氯氰菊酯降解菌草酸青霉SSCL-5分離鑒定及降解特性

陳銳 瞿佳 孫曉宇 鄧媛 門欣 趙玲俠 沈衛榮

（1. 陜西省微生物研究所微生物資源研究中心，西安 710032；2. 陜西省科學院秦嶺天然產物工程中心，西安 710032）

菊酯類農藥是目前使用最為廣泛的低毒殺蟲劑，該類農藥包括天然除蟲菊素及其衍生物30余種，通過擾亂昆蟲電壓門鈉通道使之麻痹死亡［1］。過去普遍認為菊酯類對環境及人類危害不大，但目前許多研究表明菊酯對藻類、魚類、蜂類等有較高毒性［2-4］，干擾脊椎動物內分泌［5］，引起免疫紊亂［6］，影響孕婦及兒童［7］，具有遺傳毒性［8］。為解決土壤中殘留的菊酯類農藥的問題，利用微生物進行降解是一種經濟且環保的方法［9］。微生物將農藥作為其營養來源可分解礦化有機分子成為CO2和水，可在短時間內有效降低土壤中農藥殘留的水平，使土壤恢復健康狀態［10］。有研究表明細菌［11］、真菌［12］均具有效降解菊酯類農藥的潛能。本研究從土壤中篩獲得一株真菌菌株，該菌可高效分解利用高濃度氯氰菊酯，可在較寬泛的條件下生存，并且該菌對多種菊酯類農藥均有作用，或能解決土壤中殘留菊酯類農藥的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本來源于陜西省境內棚室、果園及秦嶺等地，共收集土壤樣本70余份。

1.2 方法

1.2.1 氯氰菊酯降解菌的分離 無機鹽培養基：KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，（NH4）2SO40.4 g，NaCl 0.5 g，NH4NO31.2 g，K2HPO41.5 g，酵母提取物0.05g，pH 7.0，至1 000 mL。在搖瓶中加入100 mL液體無機鹽培養基滅菌冷卻后，加入氯氰菊酯（終濃度1 000 mg/L，大工達 10%懸浮劑），稱取土樣5 g，28℃ 180 r/min 富集培養7 d，連續轉接3次。將富集菌液梯度稀釋涂布于含氯氰菊酯（1 000 mg/L）的無機鹽固體培養基平板上，28℃培養7 d。選取菌落進行劃線純化，選擇單菌落，KMB或PDA斜面培養，待長出孢子后，取孢子液甘油-80℃低溫保藏。

1.2.2 氯氰菊酯降解菌的篩選 采用紫外分光光度法對篩選出的菌株進行氯氰菊酯降解菌的初步篩選。將獲得的菌株活化，于90 mL無機鹽培養基中加入氯氰菊酯（終濃度1 000 mg/L），接種菌液10mL，28℃ 180 r/min 震蕩培養，24 h后采用紫外分光光度法235 nm測定氯氰菊酯殘留量。取含菌發酵液4 mL，加入8 mL石油醚，振蕩器上震蕩1 min，靜置10 min，重復震蕩2次。吸取上層有機相，235 nm測定氯氰菊酯殘留濃度，標準試劑購自沈陽化工研究院（含量大于99.5%）［13］。選出最優菌株后進行進一步驗證，90 mL無機鹽培養基中加入氯氰菊酯（終濃度1 000，800，600，500 mg/L），接入菌液10 mL，設3個重復，以無菌發酵液作為平行對照，28℃，180 r/min培養，每12 h、24 h取樣1次，石油醚萃取后，紫外分光光度法235 nm測定氯氰菊酯殘留量。

1.2.3 氯氰菊酯降解菌的形態鑒定 取菌株在PDA插片平板上接種，28℃培養48 h，待菌絲長至蓋玻片上后鏡檢觀察。分別在MA及CYA平板上接種觀察其菌落形態。

1.2.4 氯氰菊酯降解菌的生長特性 菌株搖瓶生長曲線：取保藏菌種轉接斜面，28℃培養48 h，轉接3次，培養120 h待生成孢子。將孢子重懸至生理鹽水反復吹吸至均勻，接100 μL孢子懸液入PDA液體搖瓶中，共27瓶，28℃，180 r/min培養，12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h及96 h取發酵液3瓶。將全部菌體過濾至定量濾紙，烘干稱重。測定菌絲發酵生長情況。

菌株固體發酵產孢量測定：以麩皮 50 g，稻殼10 g，水40 mL，豆粕0.1 g，大米粉2 g，植物油500 μL作為固體培養基，取搖瓶培養對數期菌絲液10%接種固體發酵，28℃ 240 h培養，待孢子充分形成。取培養好的發酵固體物1 g，放入49 mL 0.5%的吐溫-80溶液中（加玻璃珠），震蕩混勻，設3次重復，取500 μL梯度稀釋，采用平板培養法進行活菌計數，計算產孢量。

1.2.5 降解菌的ITS rDNA序列鑒定 取含孢子的斜面，接種至搖瓶，28℃，180 r/min培養24 h待生成菌絲球后取含菌絲的發酵液2 mL離心，植物基因組提取試劑盒（TIANGEN DP305）提取SSCL-5菌株的基因。ITS序列擴增采用ITS1及ITS4序列引物，PCR擴增測序。測序結果利用Blast軟件在GenBank數據庫中進行比對，用系統發育樹軟件Clustal X及MEGA5.1構建分類系統發育樹。

1.2.6 草酸青霉SSCL-5對氯氰菊酯的降解率測定 準確稱取0.0500 g氯氰菊酯標準品，乙腈溶解至10 mL容量瓶（5 g/L），梯度稀釋，制作標準曲線。氯氰菊酯加入50 mL無機鹽培養基中（終濃度為500 mg/L），接入對數生長期含菌絲發酵液5 mL，設置3個重復及無菌發酵液對照，28℃、180 r/min培養0 h、12 h、24 h。在帶菌體的發酵液中加入石油醚50 mL震蕩萃取1.5 h，轉入分液漏斗，取下層有機相，上層水相轉入三角瓶，萃取3次。將有機相合并，加入無水硫酸鈉，再轉入250 mL燒瓶，56℃旋轉負壓蒸發至干，分3次加入石油醚溶解，定容至20 mL，待HPLC測定［14］。HPLC檢測：色譜柱依利特C18柱，粒徑5 μm，流動相：水+乙腈（80∶20），流速：1 mL/min，檢測波長：235 nm，進樣量：10 μL，柱溫：35℃。

1.2.7 草酸青霉SSCL-5對其他菊酯類農藥耐藥能力測定 文獻報道表明微生物對菊酯類農藥降解具有廣泛性［15］。在無機鹽培養基中分別加入不同濃度（終濃度分別為50，100，150，200，250 mg/L）的氰戊菊酯（慶豐20%乳油）、聯苯菊酯（白拜5%乳油）、溴氰菊酯（順豐2.5%粉劑）、氯菊酯（衛將25%粉劑）、氯氟氰菊酯（衛豹10%粉劑），接入對數生長期含菌絲發酵液5 mL，28℃、180 r/min培養48 h，觀察SSCL-5在該培養基中的生長情況。

1.2.8 菌劑制備及土壤室內試驗驗證 將固體發酵物在35℃條件下烘干48 h。收集干燥物于氣流粉碎機中，按照工作5 min、停止2 min間歇模式進行粉碎，粉碎至60目大小。將固體發酵孢子粉∶麩皮∶高嶺土=2∶4∶4，攪拌混合均勻，獲得菌劑。在尺寸為30 cm × 45 cm× 20 cm的土壤盒內進行室內降解試驗。人工添加氯氰菊酯至土壤中，使土壤中氯氰菊酯含量達到400 mg/kg。加入菌劑40 g攪拌均勻。中間噴施補充水分，保持溫度20-34℃，濕度40%-60%條件，一個月之后測定土壤氯氰菊酯殘留量。

2 結果

2.1 氯氰菊酯降解菌的分離

經選擇性梯度稀釋平板培養，分離獲得8株可耐受1 000 mg/L氯氰菊酯的微生物菌株。其中細菌菌株5株，真菌菌株3株。其對氯氰菊酯的利用率也有差異，需要對菌株降解能力進行進一步驗證。

2.2 氯氰菊酯降解菌的篩選

8株可利用氯氰菊酯作為唯一碳源生長的菌株中，SSCL-5的降解效果最好，如表1所示。因此選取SSCL-5作為出發菌株，0 h、12 h及24 h后測定的氯氰菊酯殘留濃度，與空白對照相比，SSCL-5顯著的降低了氯氰菊酯在發酵液中的含量。氯氰菊酯初始濃度500 mg/L的發酵液，接種12 h后降解率即可達到47.9%，對照的自然降解率為16.1%。24 h時降解率達67.9%，對照為21.7%，據有極顯著差異（如圖1，t，P=0.000 003），由于測定方法的限制，在250 mg/L以下紫外分光光度計測定值不能反映發酵液中氯氰菊酯的真實含量，需要在HPLC中精確的檢測SSCL-5的實際降解效果。

表1 篩選菌株降解效果比較

2.3 氯氰菊酯降解菌SSCL-5的形態鑒定

氯氰菊酯降解菌SSCL-5在MA平板上生長稍緩慢、在CYA平板上生長快，菌絲短、絨狀，背面無色，生成墨綠色濃密孢子。鏡檢顯示其小梗平行排列，6-10個，孢子橢圓形（圖2），鑒定該菌為草酸青霉（Penicillium oxalicum）［16］。

2.4 氯氰菊酯降解菌SSCL-5的生長特性

該菌以孢子懸液接種，28℃，180 r/min培養，于12 h進入對數生長期，大約在84 h進入平臺期，平臺期可一直維持至96 h（圖3）。在固體發酵過程中，適當的稻殼有利于通氣，使菌絲深入培養基，大量孢子一般形成于第7天，形成大約5×109個/g的孢子。

2.5 氯氰菊酯降解菌SSCL-5的ITS序列鑒定

經ITS基因擴增，測序后經GenBank比對，用系統發育樹軟件Clustal X及MEGA5.1構建系統發育樹（圖4），系統發育樹顯示該菌為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。將該序列提交基因GenBank，登錄號為：MK 163534。

2.6 草酸青霉SSCL-5對氯氰菊酯的降解率測定

HPLC檢測標準品后繪制標準曲線Y=617.54x+203 2.1（R2=0.999 9），該曲線適用范圍為5 mg/L-1 000 mg/L。經石油醚萃取-HPLC法測定，搖瓶發酵24 h后氯氰菊酯殘留量如圖5所示。12 h后氯氰菊酯在SSCL-5發酵液中殘留量為 56.9%，與對照具極顯著差異（t，P=0.024 8）。24 h后與SSCL-5發酵液中殘留量為0.2%，對照的殘留量為79.2%，具有極顯著差異（t，P= 0.000 109）。

圖1 不同濃度條件下SSCL-5菌株發酵0 h、12 h及24 h后氯氰菊酯的殘留量

圖2 SSCL-5菌株形態鑒定

2.7 草酸青霉SSCL-5對其他菊酯類農藥降解能力測定

接種于不同濃度的5種菊酯類農藥（氰戊菊酯、聯苯菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯）無機鹽培養基，其結果表明，草酸青霉SSCL-5具有廣泛的菊酯類農藥的耐受能力，并且可能具有降解其他菊酯類農藥的潛能，如表2、圖6所示。

圖3 SSCL-5菌株液體及固體生長特性

2.8 菌劑制備及土壤室內試驗驗證

SSCL-5固體發酵后期形成大量深綠色孢子，與麩皮稻殼培養基等一起經低溫烘干、間歇粉碎后形成棕色粉末。與麩皮、高嶺土的菌劑復配后形成淺棕色的菌劑。土壤室內實驗中依照土壤重量的千分之一施用菌劑。為使草酸青霉孢子在土壤中的萌發及定殖，需要土壤保持相當的濕度及松散度。保持溫度在20-34℃之間，基本不會影響真菌的生長過程。可以在土壤盒內觀察到白色菌絲迅速布滿土壤表面的過程。經石油醚萃取-HPLC法測定，土壤中400 mg/L的氯氰菊酯被降解至133.31 mg/L，降解率達67.6%（表3）。延長測定時間或降低土壤中受測氯氰菊酯的原始含量有利于菌劑對氯氰菊酯的降解效果。

圖4 SSCL-5與模式菌株建樹

圖5 石油醚-HPLC法測定不同時間氯氰菊酯降解率

表2 草酸青霉對其他菊酯類農藥的耐受

圖6 草酸青霉對其他菊酯類農藥的耐受

表3 土壤室內試驗氯氰菊酯殘留量及降解率

3 討論

近年來，大量農藥應用于農業生產過程，一方面殺蟲劑的使用有效控制植物病害，提高作物產量，促進了經濟發展，另一方面農藥的使用和濫用引起了關注［17］。殘留于土壤中的農藥一部分發生降解轉化，另一部分或累積于土壤、或被植物吸收、或揮發進入大氣、或進入地表、地下水［18-19］。農藥殘留物引起生態毒理、遺傳毒性和細胞毒性、發育和生殖毒性、畸形或慢性毒性等問題［20］。研究表明氯氰菊酯在土壤中的消解動態均符合一級動力學方程，原始沉積量與施藥量、施藥次數密切相關［21］。

微生物法降解土壤殘留農藥對于恢復生態環境、降低脊椎動物風險具有重要意義［22-23］。目前發現的對菊酯類農藥具有降解能力的微生物包括細菌：如無色桿菌屬（Achromobactersp.）［24］、芽孢桿菌（Bacillussp.）［25］、固氮弧菌（Azoarcus indigens）［26］、梭狀芽孢桿菌（Clostridiumsp.）［27］、鞘氨醇菌屬（Sphingobiumsp.）［28］、克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）［29］、沙雷氏屬（Serratiasp.）［30］、酸單胞菌屬（Acidomonassp.）［31］、假單胞菌（Pseudomonassp.）［32］等 ；放線菌：如鏈霉菌（Streptomycessp.）［33］等及真菌如黑曲霉（Aspergillus niger）［34］、木霉屬（Trichoderma viridae）［35］、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysoporium）［35］、菌膜假絲酵母（candida pelliculosa）［36］等。而大部分菌株在搖瓶內有效降解范圍低于100 mg/L。Tallur等［37］報道微球菌屬（Micrococcussp.）菌株CPN-1可將1 000 mg/L的氯氰菊酯在8 d內降解90%。Zhao等［38］報道小鏈小桿菌屬（Catellibacteriumsp.）菌株CC-5可將500 mg/L的氯氰菊酯在7 d內降解56%。在室內土壤實驗中據Akbar等人報道氯氰菊酯（200 mg/L），在42 d內可被醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌株MCm531、鞘氨醇菌屬（Sphingomonassp.）菌株RCm6、副短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）菌株FCm9、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）菌株JCm2、紅球菌屬（Rhodococcussp.）菌株JCm5或人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropic）菌株JCm1降解90% 以上［39-40］。Chen等［41］報道在田間試驗中金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）菌株HP-S-01可將氯氰菊酯（50 mg/L）降低81.1%。Tallur、Zhao及Chen等［36-38，41］均研究了氯氰菊酯在細菌（微球菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、地衣芽孢桿菌和鞘氨醇單胞菌）中的降解途徑。細菌主要通過羧酸酯酶的酯鍵水解作用產生羧酸和醇。經過羧酸酯酶的作用可將氯氰菊酯水解，3-苯氧基苯甲酸是氯氰菊酯細菌降解的的主要代謝產物之一。而3-苯氧基苯甲酸屬雌激素類物質，具有相當的生殖毒性［42］。在本研究中除草酸青霉SSCL-5也發現惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、無色桿菌（Achromobactersp.）、噬線沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）等菌株，對氯氰菊酯具有一定的降解性能。但部分菌株具有條件致病性如陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）等，部分不形成孢子的細菌例如鞘氨醇桿菌（Sphingobacteriumsp.）、韓國假單胞菌（Pseudomonas koreensis）等，均不利于應用型研究的開展。目前有關真菌降解菊酯類農藥的研究報道不多，但真菌可產生大量孢子有利于生產制備及其在土壤環境中定殖。真菌孢子的生長速度及其孢子數量的多少決定了其在土壤中定殖能力的大小及微生物菌劑制備成本的高低，生長速度越快形成孢子數量越高則越有利于其產業化開發。因此草酸青霉的代謝途徑有待于進一步的研究。

4 結論

本研究采用多重篩選方法從70余份土壤中獲得一株高效分解利用菊酯類農藥的微生物菌株SSCL-5，該菌株可在含1 000 mg/L的氯氰菊酯無機鹽培養基中正常生長。經鑒定確定該菌為草酸青霉（Penicillium oxalicum），產深綠色孢子。經紫外分光光度法及HPLC證實，在無機鹽培養基（氯氰菊酯400 mg/L）、28℃、180 r/min搖瓶培養24 h的條件下，草酸青霉SSCL-5對氯氰菊酯的降解率為97%。可在含其他多種菊酯類農藥的培養基中正常生長。土壤室內試驗證明，在土壤中，溫度20-34℃、水分含量保藏40%-60%，30 d條件下，草酸青霉SSCL-5可將土壤中400 mg/L的氯氰菊酯降解67.6%。顯示了該菌株在解決氯氰菊酯在土壤殘留問題中的潛能。