好氧反硝化菌Achromobacter sp.L16的脫氮特性

李思琦 楊靜丹 劉琳 劉二佳 王曉慧

（1. 北京化工大學化學工程學院，北京 100029；2. 北京航天宏圖信息技術股份有限公司，北京 100195）

異養硝化-好氧反硝化（Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HN-AD）菌是一類能夠在有機物存在的條件下將氨氮氧化，在溶解氧存在條件下將亞硝態氮、硝態氮代謝為氮氣的微生物［1］，不受傳統反硝化菌厭氧條件的控制，在單個反應器中同時進行硝化和反硝化，且異養菌與自養菌相比生長速率快，繁殖周期短，節約工藝處理時間及成本，好氧反硝化菌的發現為生物脫氮技術提供了一種新的思路和方法［2］。

長期以來厭養反硝化菌被認為是唯一能夠進行反硝化作用的細菌。1980年，Meiberg等［3］在研究HyphomicrobiumX菌對二甲胺的好氧厭氧降解機理過程中發現其具有好氧反硝化能力，1983年Robertson等［4］在硫自養反硝化菌株分離實驗中發現了好氧反硝化菌的存在，隨后證實泛養硫球菌是一種好氧反硝化菌，打破了傳統厭氧反硝化的壁壘。目前從環境中分離出來的好氧反硝化菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）［5-6］、不動桿菌屬（Acinetobacter）［7］、芽孢桿菌屬（Bacillus）［8-9］、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）［10］、硫桿菌屬（Thiobacillus）等［11］。

本研究從河北某垃圾處理廠的垃圾滲濾液中提取出一株好氧反硝化菌L16，對其進行16S rDNA分析鑒定為無色桿菌，填補了垃圾滲濾液中好氧反硝化細菌較少的空缺，系統地研究了碳源、C/N、溫度、轉速等理化因素對該菌株反硝化和硝化能力的影響，以期為該菌株在滲濾液脫氮處理等應用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌源提取自河北某垃圾填埋場的垃圾滲濾液，樣品置于采樣瓶中4℃保存，用于后續實驗。

LB富集培養基（g/L）：胰蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，硝酸鉀KNO32.0 g。

BTB溴百里酚藍固體培養基（g/L）：KNO31.0 g，琥珀酸鈉 8.5 g，KH2PO41.0 g，FeCl2·6H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，1%的溴百里酚藍1 mL，瓊脂20.0 g。

NI異養硝化培養基（g/L）：NH4Cl 1.5 g，琥珀酸鈉 11 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，Na2HPO4·12H2O 6.7 g，KH2PO41.0 g，微量元素溶液2 mL。

DM好氧反硝化培養基（g/L）：KNO33.0 g，琥珀 酸 鈉 13 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，Na2HPO4·12H2O 7.9 g，微量元素溶液2 mL。

微量元素溶液（g/L）：EDTA 50.0 g，ZnSO42.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 2.06 g，FeSO4·7H2O 5.0 g，（NH4）6Mo7O2·7H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g。

培養基調節pH為7.0-7.3，在121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 取垃圾滲濾液10 mL按10%（V/V）接種在LB培養基中，30℃，150 r/min條件培養，24 h后取10 mL重新接種至新鮮LB培養基，連續富集培養5次，用格利斯試劑定性檢測硝酸鹽是否轉化為亞硝氮，培養基變紅，垃圾滲濾液中的菌群有反硝化活性。

富集菌液按倍比稀釋，取10-6和10-7濃度菌液涂布在BTB培養基，30℃恒溫培養3 d。反硝化細菌消耗硝酸鉀產生堿度，使溴百里酚藍變藍，挑取藍色單菌落在BTB培養基上多次劃線培養純化作為初篩菌株。

挑取初篩純菌株接種于LB培養基，30℃，150r/min條件下富集24 h，4 000 r/min離心3 min，棄去上清液加入無菌水制備菌懸液。將菌懸液以2%（V/V）接種至DM和NI培養基中培養2 d，復篩出降解硝氮、氨氮能力最強的菌株，命名為L16。富集培養保存在甘油管中，在-20℃冰箱里暫存。所有操作在無菌臺上進行，培養基及其他儀器事先滅菌。

1.2.2 菌株鑒定 將菌株L16富集培養制備菌懸液，在BTB培養基劃線培養24 h，挑取單菌落通過掃描電子顯微鏡（JSM-7500F型）觀察菌體形態。

將菌株L16富集培養制備菌懸液，在BTB培養基劃線培養，通過16S rDNA分析鑒定。過程為：利用DNA提取試劑盒提取，用DNA通用引物進行PCR擴增，上游引物（27F）5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物（1429R）5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR體系：10×Ex Taq緩沖液5.0μL，2.5 mmol/L dNTP 混合物 4.0 μL，10 pmol/L 引物各 1.0 μL，模板 2.0 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，無菌水 36.5 μL，共 50 μL，擴增程序 ：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，經過30個循環，72℃延伸10 min，4℃保溫。將PCR產物經電泳檢測條帶單一、大小正確后，經切膠回收克隆后測序。測序結果在EZbiocloud網站上進行同源性比對，構建系統發育樹。

1.2.3 菌株異養硝化-好氧反硝化性能研究 將菌株L16富集制備菌懸液以2%（V/V）分別接種至100 mL DM、NI培養基，測定其好氧反硝化和異養硝化能力，控制單一變量，分別在不同碳源（乙酸鈉、葡萄糖、甘油、檸檬酸鈉和琥珀酸鈉），不同碳氮比（0、5、10、15、20和25），不同溫度（20、30和37℃），不同轉速（50、100、150和200 r/min）下，30℃，150 r/min培養48 h（溫度、轉速實驗除外），每隔12 h檢測菌株生長量，每隔6 h檢測DM培養基中硝氮、亞硝氮濃度和NI培養基中氨氮濃度，并測量總氮濃度變化。

1.2.4 測定方法 生長量（OD600）采用分光光度法（GB/T 26810-2011），氨氮采用納氏試劑分光光度法（GB HJ535-2009），硝氮采用麝香草酚法分光光度法（GB HJ/T346-2007），亞硝氮采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法（GB 7493-87），總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB HJ636-2012）。

氨氮去除率：

硝氮、亞硝氮、總氮去除率計算公式同上。

2 結果

2.1 菌株形態特征

L16菌落培養及掃描電鏡圖如圖1，菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，呈乳白色，透明，菌體大小約1.6 μm×0.18 μm。

圖1 菌株L16的形態特征

2.2 16S rDNA序列及系統發育分析

對菌株L16測序得到1 420 bp長度的16S rDNA基因序列，在EZbiocloud網站上進行同源性比對，菌 株 L16與Achromobacter insuavis、Achromobacter ruhlandii、Achromobacter xylosoxidans、Alcaligenes faecalis、Achromobacter denitrificans及Achromobacter piechaudii相似性均在99%以上，初步確定菌株L16為無色桿菌（Achromobactersp.）通過MEGA 7.0軟件，以Neighbor-Joining法構建系統發育樹如圖2，菌株L16與Achromobacter insuavisLMG26845具有99.7%同源性。目前分離出多種異養硝化-好氧反硝化菌，無色桿菌較少，本研究分離的無色桿菌L16豐富了異養硝化-好氧反硝化細菌的多樣性，也表明無色桿菌在脫氮領域具有潛在的應用價值。

2.3 菌株脫氮特性

2.3.1 好氧反硝化特性 菌株L16的生長曲線如圖3-A，前12 h濁度由0.030增長到0.072，硝氮由569.2 mg/L降至550.0 mg/L，均無明顯變化，此階段為菌體的適應期。從12-36 h培養基細胞生物量迅速增加，細菌處于對數生長期，硝氮含量降至8.996 mg/L，亞硝氮含量增加到244.5 mg/L，說明菌株L16的好氧反硝化過程是消耗硝氮產生亞氮進而轉化為氮氣或自身生物量積累，此過程硝氮去除率達98.40%，菌株對硝氮的去除主要發生在對數生長期，反硝化效果性能突出。36 h后培養基各物質含量變化不大，濁度基本穩定，且有減小的趨勢，細菌在36 h后處于穩定期并逐漸進入衰減期。

2.3.2 異養硝化特性 菌株L16的生長曲線與DM培養基中相似，前12 h濁度由0.015增至0.018，氨氮由314.6 mg/L降至285.6 mg/L，去除率9.22%，為細菌的適應期。從12 h-36 h培養基濁度迅速增加，氨氮濃度降至110.6 mg/L，去除率61.5%，此時處于對數生長期，此后進入穩定期并逐漸進入衰減期（圖3-B）。菌株L16是兼具異養硝化-好氧反硝化能力的菌株，其好氧反硝化能力更強。

2.4 環境因素對菌株L16好氧反硝化性能的影響

2.4.1 碳源對菌株L16好氧反硝化能力的影響 碳源對菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-A，菌株L16以乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為唯一碳源時，硝氮基本完全去除，去除率分別為99.61%、99.15%和99.74%，總氮去除率分別為28.79%、38.85%和29.00%，培養基初始時總氮包括培養基的硝氮和細菌胞內氮，48 h后硝氮一部分轉化為亞硝氮，一部分直接轉化為N2排出，其余部分轉化為細菌胞內氮，其48 h后總氮含量變化近似于轉化為N2部分的氮損失。

圖2 菌株L16系統發育樹

圖3 菌株L16異養硝化-好氧反硝化特性

以甘油為唯一碳源時生長效果最好，對硝氮去除率僅10.16%，總氮的去除率6.72%，說明菌株能夠利用甘油生長但沒有好氧反硝化能力，可能是因為碳源為微生物生長提供所需的能量和好氧反硝化過程中的電子供體，碳源不同，細菌生長速率不同，硝酸鹽的還原和中間產物的積累程度也不同，對反硝化速率影響很大。本研究中無色桿菌L16在不同碳源的培養基中脫氮效果由高向低依次為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、甘油，檸檬酸鈉培養基中硝氮去除率高，其總氮去除率最高，亞硝氮積累量為296.5 mg/L，剩余部分氮轉化為細胞生物量，菌株L16以檸檬酸鈉為碳源時好氧反硝化能力最好。

2.4.2 C/N對菌株L16好氧反硝化能力的影響 碳氮比對菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-B，固定DM培養基氮源含量，使用2.4.1中好氧反硝化能力最好的檸檬酸鈉為碳源，改變檸檬酸鈉含量以改變碳氮比。在碳氮比達到10以上后，對硝氮的去除能力基本穩定，均在97%以上，在碳氮比為20、25時總氮去除率最高分別為58.90%、56.79%，且亞硝氮積累量也相較于碳氮比為15時有所降低。

在碳氮比為15時OD600達3.304，菌株生長最好，亞硝氮在碳氮比為15條件下積累量最高，菌株L16在碳氮比為0、5時基本不生長，說明菌株L16生長過程需要外加碳源，是異養的反硝化菌。碳氮比對菌株生長情況有顯著影響，低的反硝化能力可能是碳源不足菌體生長不良導致。本研究中碳氮比為20的培養基中總氮去除率最高，硝氮去除率為97.12%，亞硝氮積累量為231.6 mg/L，在碳氮比為20時L16的反硝化能力最好。

2.4.3 溫度對菌株L16好氧反硝化能力的影響 溫度對菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-C，在以檸檬酸鈉為碳源，碳氮比為20的DM培養基中實驗，培養溫度為30、37℃的菌株基本將硝態氮降解完全，去除率分別為97.56%、96.97%，30℃下的菌株生長及總氮去除能力都比37℃時要好，可能是高溫導致生物核酸或蛋白的變性，細胞功能下降，影響脫氮效果。

菌株在3個培養溫度下均能正常生長，30、37℃時OD600達到2.772和2.562，而20℃時為1.512，在20℃生長情況較其他溫度稍差，且基本不降解硝態氮，同時也沒有亞硝態氮的產生，說明低溫對于菌株L16的生長和好氧反硝化有明顯的抑制作用，可能是低溫抑制了酶活性，影響其脫氮效果。30℃條件下總氮去除率為43.87%，亞硝氮積累223.0mg/L，對菌株L16好氧反硝化能力較好的培養溫度應在30℃左右。

2.4.4 溶解氧對菌株L16好氧反硝化能力的影響 溶解氧對菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-D，調整培養箱轉速來改變溶解氧濃度，圖中表明溶解氧含量越高，細菌生長狀況越好，驗證了菌株L16為好氧菌。各培養基對于硝態氮的去除趨勢一致，且去除效果基本相同，將氮轉化為氣體的能力與溶解氧含量成正比，最后硝態氮都穩定在10 mg/L以下，去除率分別為97.79%、97.30%、99.83%和98.15%，在培養后期均有降解亞硝酸鹽的能力，菌株L16在150 r/min下脫氮效果最好，可能是因為HN-AD 菌株在好氧條件下進行反硝化，但亞硝酸鹽還原過程對氧極其敏感，高濃度溶解氧會抑制亞硝酸鹽的還原，低濃度溶解氧又抑制異養菌株的生長，過高過低的溶解氧量都會影響菌株的脫氮能力。其中150 r/min轉速的培養基積累亞硝態氮含量少，且硝態氮去除能力最強，亞硝氮積累量為245.5 mg/L，總氮去除率48.44%，菌株L16最適的轉速在150 r/min左右。

2.5 環境因素對菌株L16異養硝化性能的影響

2.5.1 碳源對菌株L16異養硝化能力的影響 碳源對菌株L16異養硝化能力的影響如圖5-A，菌株L16以氨氮為氮源，以檸檬酸鈉為碳源時對氨氮和總氮去除率最高，這與前面好氧反硝化性能影響實驗一致，可能是由于檸檬酸鈉參與細胞三羧酸循環，能夠更加有效的被菌體利用。

以葡萄糖為碳源的菌株生長最好，但以甘油和葡萄糖為碳源的菌株去除氨氮的能力較差，以乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為碳源的培養基中后期氨氮穩定在35 mg/L以下，對氨氮的去除率分別為62.33%、67.90%和62.02%，菌株L16在不同碳源的培養基中脫氮效果由高向低依次為檸檬酸鈉、乙酸鈉、琥珀酸鈉、葡萄糖和甘油，在以檸檬酸鈉為碳源的培養基中對氨氮去除率最高，總氮去除率為54.72%，菌株L16以檸檬酸鈉為碳源時異養硝化能力最好。

2.5.2 C/N對菌株L16異養硝化能力的影響 C/N對菌株L16異養硝化能力的影響如圖5-B，培養基以檸檬酸鈉為碳源，隨碳氮比的增加，菌株生長情況越好，且對氨氮和總氮去除率也逐漸升高，說明碳氮比能夠顯著影響菌株的生長情況及其異養硝化能力。

菌株L16在C/N為0、5時基本不生長，氨氮去除能力也低，可能是碳氮比小時碳源不充分，細菌生長受限制，異養硝化能力受影響。48 h后，碳氮比為15、20和25的培養基中氨氮的去除效果分別為95.79%、96.31%和97.51%，在C/N為25時OD600達1.477，菌株生長最好，且總氮去除率也最高為90.58%，考慮到實際應用中高碳氮比投加碳源的成本以及可能造成水體化學需氧量的升高，可以取碳氮比為20作為菌株L16異養硝化能力的碳氮比，其總氮去除率也可達到86.79%。

2.5.3 溫度對菌株L16異養硝化能力的影響 溫度對菌株L16異養硝化能力的影響如圖5-C，取檸檬酸鈉為碳源，碳氮比為20，菌株在3個培養溫度下均能正常生長，且20℃下生長情況最好，3種溫度下氨氮去除率分別為95.56%、97.19%和96.87%，低溫對于菌株L16的硝化作用基本沒有影響，其異養硝化作用受溫度影響小，其中培養溫度為30℃時的氨氮去除率最大，總氮去除率最高為78.24%，對菌株L16異養硝化能力較好的培養溫度可以在20-37℃左右。

2.5.4 轉速對菌株L16異養硝化能力的影響 轉速對菌株L16異養硝化能力的影響如圖5-D，各培養基對于氨氮去除效果基本相同，去除率分別為90.87%、83.23%、89.87%和93.41%，轉速對菌株L16的硝化作用沒有太大影響，異養硝化能力最好的是轉速200 r/min的培養基，總氮去除率為87.50%；其次是轉速為50 r/min的培養基，總氮去除率為86.33%，菌株L16的異養硝化能力對溶解氧的要求不高，菌株L16異養硝化能力較好的轉速可以在50-200 r/min左右。

圖4 環境因素對菌株L16好氧反硝化能力的影響

2.6 菌株L16好氧反硝化-異養硝化性能的優化

以單因素實驗中脫氮能力最強的環境因子作為實驗條件，即以硝酸鹽為氮源、檸檬酸鈉為碳源、C/N為20、培養溫度為30℃、培養轉速為150 r/min條件下培養48 h，優化環境因素影響后L16對硝酸鹽去除率99.74%，總氮去除率為58.90%。

L16在以氨氮為氮源、檸檬酸鈉為碳源、C/N為20、培養溫度為30℃、培養轉速為200 r/min條件下氨氮去除率提高到93.41%，總氮去除率86.33%（圖 6）。

3 討論

在探究環境因素對菌株L16的異養硝化-好氧反硝化性能的影響實驗中，L16在碳源為檸檬酸鈉的培養基中脫氮效果最好，這與Enterobacter asburiaeYT［12］和Acinetobactersp. T1［13］結果一致，其他研究也有以丁二酸鈉［14］、琥珀酸鈉［15］、葡萄糖［16］為唯一碳源時效果最好，說明碳源為微生物生長提供所需的能量和好氧反硝化過程中的電子供體，對微生物的生長和脫氮能力影響很大。L16在碳氮比為20的培養基中脫氮效果最好，低于田雪雪等［17］分離的醋酸鈣不動桿菌N7，與克雷伯氏菌y5［1］和y6［18］結果相似，目前有些研究中分離在低碳氮比（5-10）下進行好氧反硝化的菌株［19-24］，有效解決生物法處理低C/N比廢水存在碳源不足、脫氮效率不高的問題。L16在 30℃下培養脫氮效果最好，在大部分好氧反硝化菌生長最適溫度范圍內［8，25-29］，也有學者在從低溫環境下提取出嗜冷菌株［30-34］，能耐10-15℃低溫。L16異養硝化-好氧反硝化最適轉速分別在200 r/min和150 r/min左右，與假單胞菌 WUST-7［6］和發光細菌 NNA4［35］結果相似，轉速對細菌脫氮能力的影響可能是由于亞硝酸鹽還原過程對氧敏感，高濃度溶解氧會抑制亞硝酸鹽的還原，低濃度溶解氧又抑制異養菌株的生長，過高過低的溶解氧量都會影響菌株的脫氮能力［10］。以最佳環境因子作為培養條件優化L16的脫氮能力，硝酸鹽氮去除率99.74%，氨氮去除率提高到93.41%，說明環境因素顯著影響L16的異養硝化-好氧反硝化能力。

圖5 環境因素對菌株L16異養硝化能力的影響

圖6 菌株L16好氧反硝化-異養硝化性能的優化

4 結論

（1）從垃圾滲濾液中提取出一株HN-AD菌，對其進行16S rDNA同源性分析，結果為無色桿菌（Achromobacter insuavisLMG26845）。對其好氧反硝化下硝氮去除率達98.4%，同時具有異養硝化能力，異養硝化的氨氮去除率為61.5%。

（2）對菌株L16的好氧反硝化能力進行影響因素分析，在以乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為碳源，C/N為15-5，培養溫度為30-37℃，培養轉速為100 r/min-200 r/min，其中以檸檬酸鈉為碳源，C/N為20，培養溫度為30℃，培養轉速為200 r/min時的脫氮能力最強。

（3）對菌株L16的異養硝化能力進行影響因素分析，在以乙酸鈉、檸檬酸鈉和琥珀酸鈉為碳源，C/N為15-25，培養溫度為20-37℃，培養轉速為50 r/min-200 r/min，其中以檸檬酸鈉為碳源，C/N為25，培養溫度為30℃，培養轉速為200 r/min時的脫氮能力最強。

（4）對菌株L16異養硝化-好氧反硝化能力優化，在脫氮能力最佳的環境因素下，L16的好氧反硝化硝酸鹽氮去除率為99.74%，總氮去除率58.90%。L16異養硝化的氨氮去除率提高到93.41%，總氮去除率86.33%。