激素耐藥型腎病綜合征兒童與COL4A5基因突變的關系研究

張玉霞 趙青

【摘要】目的 探討糖皮質激素（激素）耐藥型腎病綜合征（SRNS）兒童與Ⅳ型膠原A5（COL4A5）基因突變的關系。方法 選取51例原發性腎病綜合征（PNS）患兒，其中經足量激素治療4周無效的患兒即SRNS 26例，經足量激素治療4周有效的患兒即激素敏感型NS（SSNS）25例，并選擇同期體檢的27名健康兒童作對照，采集外周血提取DNA，并進行DNA測序。結果 COL4A5基因突變僅在PNS患兒中檢出而在對照組中未檢出。51例PNS患兒中，檢出COL4A5基因突變16例，其中散發突變和遺傳突變各8例。SRNS患兒的COL4A5基因突變檢出率為46%，高于SSNS患兒的16%（P < 0.05）。SRNS患兒和SSNS患兒的突變來源比較差異無統計學意義（P > 0.05）。結論 COL4A5基因突變和PNS的發生有關，且該突變可能與患兒激素耐藥有關。

【關鍵詞】糖皮質激素耐藥型腎病綜合征;脫氧核糖核酸測序;Ⅳ型膠原A5;基因突變

【Abstract】Objective To investigate the relationship between steroid-resistant nephrotic syndrome （SRNS） and type Ⅳ collagen alpha 5 （COL4A5） gene mutation in children. Methods A total of 51 children with primary nephrotic syndrome （PNS） were enrolled. Twenty-six children who were not healed after 4-week adequate hormone therapy were assigned into the SRNS group， 25 patients who were effectively treated with adequate hormone therapy were allocated into the steroid-sensitive NS （SSNS） group， and 27 healthy children receiving physical examination were recruited as normal controls. DNA was extracted from the peripheral blood of PNS and healthy children. DNA sequencing was performed. Results COL4A5 gene mutation was detected in the PNS children rather than the normal controls. Among 51 PNS children， COL4A5 gene mutation was identified in 16 children including 8 cases of sporadic and 8 cases of genetic mutations. The COL4A5 gene mutation rate in the SRNS group was 46%， significantly higher compared with 16% in the SSNS group （P < 0.05）. The source of mutation did not significantly differ between the SRNS and SSNS children （P > 0.05）. Conclusion The COL4A5 gene mutation is closely correlated with the occurrence of PNS， which is probably associated with the steroid resistance in children.

【Key words】Steroid-resistant nephrotic syndrome;DNA sequencing;Type Ⅳ collagen alpha 5; Gene mutation

腎病綜合征（NS）是兒童期常見的腎小球疾病，其臨床癥狀多見蛋白尿、低蛋白血癥和不同程度的水腫等[1]。大部分患兒對于糖皮質激素（激素）治療敏感，但有10% ～ 20%的患兒經足量激素治療后蛋白尿仍為陽性，這類稱為激素耐藥型NS（SRNS），這類患兒大多會很快發展為終末期腎病[2]。SRNS不僅給患兒家庭帶來沉重的經濟負擔，而且患兒由于長時間大量服用激素，易引起代謝紊亂，引發其他疾病[3]。近年來，隨著分子生物學研究的進展，有關SRNS發生發展的研究進入分子和基因水平，認為基因突變可引發SRNS[4]。腎小球基底膜是其濾過屏障中不可或缺的一部分，而作為腎小球基底膜中支架結構的Ⅳ型膠原蛋白同樣在濾過屏障過程中發揮著關鍵作用[5]。Ⅳ型膠原A5 （COL4A5） 基因是編碼Ⅳ型膠原分子的一級結構6條α鏈的基因之一。Ⅳ型膠原的6種α鏈可組成3種三聚體，其中α3α4α5三聚體是腎小球基底膜的重要組成部分[6]。已有報道表明Ⅳ型膠原編碼基因COL4A3、COL4A4和COL4A5的突變可造成多種異質性的腎臟疾病，其中包含Alport綜合征（AS）、良性家族血尿（BFH）和局灶節段性腎小球硬化（FSGS）等[7]。目前有關NS與COL4A5基因突變的相關報道較少。為此，本研究對PNS患兒進行COL4A5基因測序，分析COL4A5基因突變和PNS疾病的關系，并探討COL4A5基因突變與SRNS的相關性，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選取2017年12月至2019年1月在我院兒科就診的51例原發性NS（PNS）患兒為研究對象。51例患兒中，男35例、女16例，年齡5 （1，9）歲，有血尿癥狀24例，發展為終末期腎病（ESRD） 3例。15例行腎穿刺病理檢查，其中局灶性節段性腎小球硬化癥（FSGS） 6例、微小病變型腎病（MCNS）4例、系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）3例、膜性腎病（MN）1例、彌漫性系膜硬化（DMS）1例。經足量激素治療4周無效的患兒即SRNS患兒26例、經足量激素治療4周有效的患兒即激素敏感型NS（SSNS）患兒25例。另選擇同期來我院體檢的27名無腎病家族史和腎病病史健康兒童作對照。本研究經過醫院倫理委員會批準，入組兒童均由其監護人簽署知情同意書。

二、診斷標準

兒童PNS的診斷標準：①1周內有3次的尿蛋白定性為（+++）～（++++）或隨機或晨尿中的尿蛋白/尿肌酐≥2.0，24 h尿蛋白定量≥50 mg/（kg·d）;②血清白蛋白≤25 g/L;③血清膽固醇> 5.7 mmol/L;④有水腫現象。其中①和②為診斷PNS的必要條件。排除標準：①出生3個月以內即發病的先天性NS;②有全身性疾病導致過相關的腎損害;③腎臟病理活組織檢查（活檢）結果為膜增生性腎小球腎炎或泌尿生殖系統畸形等;④經耳和眼部檢查診斷為Alport綜合征。

三、主要試劑及儀器

人血液基因組DNA提取試劑盒購于天根生物技術有限公司。實驗所需的引物由上海生工生物技術有限公司合成。熒光染料等購自日本TaKaRa公司。高速低溫離心機購自德國Heraeus公司。超低溫冰箱購自Millus公司;NanoDrop ND-2000紫外分光光度計購自美國NanoDrop公司。微量移液器購自美國Thermo公司。實時定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

四、DNA測序

取患兒和對照健康兒童外周血1 ml，根據說明書，使用基因DNA試劑盒抽提基因組DNA，送廣州嘉檢醫學檢測有限公司完成目標DNA測序，所鑒定的基因突變致病性是基于以下標準中的至少一種：①截短突變（無義，共有剪接位點多或者少1或2個堿基，大片段缺失和移碼）;②先前描述為人類基因組突變數據庫（HGMD）、人類基因變異數據庫（LOVD）網站和美國國立生物技術信息中心（NCBI）主辦的與疾病相關的人類基因組變異數據庫ClinVar中具有相似表型患兒中引起疾病的變體;③中間的甘氨酸錯義變體（COL4A5中的p.Gly624 Asp除外），新的非甘氨酸替代物在大種群[千人基因組、人類外顯子組整合數據庫（ExAC）、人類基因組整合數據庫（gnomAD）]中不存在或頻率很低，在領域內高度進化守恒，并有2個以上的預測分數將等位基因歸類為致病基因（SIFT， Mutation Taster， Polyphen 2）。采用NCBI的序列和結果比對，當出現基因變異結果時，另檢測互補鏈來明確變異是否存在。從NCBI數據庫中獲得COL4A5基因序列（GeneBankID 9606，MIM 303630）、mRNA序列（NM_000495.4）和蛋白質序列（NP_000486.1）。根據人類DNA序列變異命名建議為突變基因命名。

五、統計學處理

采用SPSS 21.0對研究數據進行分析。計量資料以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、3組兒童的一般資料比較

SRNS患兒26例，男19例、女7例，年齡5.4（1.5，9.2）歲。SSNS患兒25例，男16例、女9例，年齡5.5（1.8，8.7）歲。對照組27名，男19名、女8名，年齡6.0（1.5，8.9）歲。3組兒童的性別構成、年齡比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。

二、PNS患兒和對照組健康兒童的COL4A5基因檢測結果

1. 總體情況

51例PNS患兒按入院順序編號，共16例（31%）檢出COL4A5基因突變，其基因突變涉及多種形式，包括單堿基突變導致氨基酸改變如c.2858G>T（p.G953V）、剪切突變如c.834+5G>T、堿基缺失如c.3049-3051 delinsA（p.P1017Rfs*2）等;其中散發突變8例、遺傳突變8例，見表1。對照組27名健康兒童均未檢出COL4A5基因突變。

2. 散發和遺傳性COL4A5基因突變的典型檢測結果

散發來源：編號7患兒，取樣時6歲半，臨床癥狀為反復肉眼血尿，B超提示左腎靜脈受壓，腎病理檢測結果顯示腎小球病變輕微，基底膜偏薄，自身抗體、體液免疫檢測結果未見異常，患兒父母未有相應臨床表現。檢測到COL4A5基因雜合變異c.1117C > T （p.R373*），見圖1A。患兒父母并無攜帶這個變異，此變異是新發的，為罕見的無義變異，預測可能會導致蛋白質合成提前出現氨基酸的終止密碼。該變異在AS相關臨床病例中被報道過（PMID： 8651296），在參考人群基因數據庫中頻率較低。結合送檢患兒的臨床表現，依據美國ACMG 變異分類指南（PMID： 25741868），此變異為“1類-致病突變”。

遺傳來源：編號39患兒，取樣時9歲，臨床癥狀為持續1年血尿、尿蛋白高，腎臟病理檢測顯示有局灶性節段性腎小球硬化癥狀。患兒父母無相應臨床表現。此次檢測檢出COL4A5基因半合子變異c.1579G > T（Gly > Cys），見圖1B。驗證試驗顯示該變異遺傳自送檢者的母親（雜合狀態）。此變異為罕見的無義變異，預測可能會導致蛋白質合成提前出現氨基酸的終止密碼。該變異沒在相關臨床病例或參考人群基因數據庫中報道。結合送檢患兒的臨床表現和家系分析，依據美國ACMG變異分類指南（PMID：25741868），此變異為“2類-可能致病”。

三、COL4A5基因突變與激素耐藥性的關系分析

SRNS患兒的COL4A5基因突變檢出率為46%（12/26），高于SSNS患兒的16% （4/21） ?（χ2 = 5.382，P = 0.020）。12例檢出COL4A5基因突變的SRNS患兒中，散發突變5例、遺傳突變7例。4例檢出COL4A5基因突變的SSNS患兒中，散發突變3例、遺傳突變1例，SRNS患兒和SSNS患兒的突變來源比較差異無統計學意義（P = 0.569）。

討論

NS是一種以蛋白尿、低蛋白血癥、不同癥狀水腫為臨床癥狀的慢性腎臟病。目前激素是NS的一線治療藥物，但部分NS患兒經足量激素治療仍無緩解或再次復發后使用激素治療無效，這部分NS被稱為SRNS。研究表明，遺傳、免疫缺陷、腎小管損傷和耐藥基因的異常表達等均可能導致SRNS [8]。如果能明確地診斷SRNS將可減少甚至避免大劑量激素治療和免疫抑制治療對患兒帶來的影響。COL4A5是編碼Ⅳ型膠原分子一級結構α5肽鏈的基因，α5肽鏈可和α3、α4形成三螺旋分子結構，α5 （Ⅳ） 鏈在腎小球基底膜含量較高，是腎小球基底膜的重要組成部分[6]。由Ⅳ型膠原異常導致的疾病多與腎臟相關，如COL4A5突變引起的AS即眼-耳-腎綜合征，就是由于Ⅳ型膠原異常導致的[9]。Goodpasture綜合征是一種危及生命的疾病，其主要特點是存在抗腎小球基底膜的抗體，有報道表明α5 （Ⅳ）鏈的NC1區存在該抗原決定簇，基因突變會導致該疾病的發生[10]。COL4A5突變相關腎病的研究較多，但目前有關COL4A5突變和PNS的相關報道較少，因此本研究以本地區PNS患兒為研究對象，探究其與COL4A5基因突變的關系。

Ⅳ型膠原編碼基因COL4A3、COL4A4和COL4A5的突變可造成多種異質性的腎臟疾病，包含AS、BFH和FSGS等，研究表明COL4A4和COL4A5基因和FSGS的發生密切相關[11]。而FSGS又是NS的典型病理特征之一[12]。目前，關于兒童PNS是否和COL4A5基因突變有關的報道很少，為此，本研究取PNS患兒和健康兒童的血液樣本提取基因組DNA進行測序，測序結果顯示健康兒童均未檢出COL4A5基因突變，僅PNS患兒有COL4A5基因突變，這部分基因突變涉及單堿基突變導致的氨基酸改變、剪切突變和堿基缺失等，且COL4A5基因突變有散發也有家族性來源，其中散發突變和遺傳突變患兒各8例，這表明PNS的患兒基因中確實存在COL4A5基因的突變。

為了探究SRNS是否和COL4A5基因突變有關，我們進行了進一步的分析。研究表明SRNS涉及遺傳學因素，其發生和許多基因的突變密切相關，如在家族性和出生2年內發生SRNS患兒中有基因突變的約為95%，而且基因突變導致的SRNS和繼發性的SRNS相比較病程發展更快，并且其對激素或相關免疫治療反應性更差[13]。同時，隨著測序技術的快速發展，臨床應用更加普遍，目前已發現至少50多個遺傳基因和SRNS的發生相關，包括NPHS2、LMX1B、WT1等[14-16]。本研究表明，PNS患兒的COL4A5基因突變與患兒激素耐藥有關，結合已有研究，說明COL4A5基因突變很可能是PNS患兒激素耐藥的相關因素，其可能可以作為篩查和早期診斷SRNS的一個分子標志物，為SRNS患兒避免激素或免疫治療提供生物學參考依據。本研究中，COL4A5基因突變散發還是遺傳來源與激素耐藥無關，但是考慮到SRNS的家族遺傳相關性，本研究樣本量較少，因此尚不能下確切結論，日后將進行多方面研究以確認研究結論。

綜上所述，COL4A5基因突變和PNS的發生有關，且該突變可能與患兒激素耐藥有關。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-08-20）

（本文編輯：林燕薇）