新型骨缺損斑馬魚模型構建及修復過程的OCT活體評價

陳婷如， 林燕萍， 謝青軒， 藍銀濤， 邱 婷， 向 湘， 王俐梅， 張 建*

(1.廣州醫科大學基礎醫學院生物醫學工程系， 廣州 511436；2.廣東省生物資源應用研究所藥物非臨床評價研究中心， 廣州 510260)

現代醫學的核心目標是解決由于疾病、創傷、衰老或遺傳等因素造成的組織器官缺損及功能障礙。再生醫學的出現給組織器官的修復再生和功能重建帶來了希望，是人類醫學發展的又一次巨大飛躍[1-3]。設想如果人類有能力將再生醫學與臨床醫學無縫銜接，絕大多數疾病就能治愈，社會老齡化將不再是人類的噩夢，人們就可實現長壽之夢。因此，對再生醫學的研究與探討已經成為一個重大且熱門的世界醫學科學問題。在再生醫學相關研究中，動物模型發揮著至關重要的作用[4-6]。以骨缺損和骨質疏松為代表的骨疾病造成的活動失能極大地影響人的生活質量，更為嚴重的是，隨著老齡化的到來，這些骨病的發病率日益增高，延緩和治療骨疾病目前已經成為醫藥領域科研工作全力解決的問題[7-9]。近年來，斑馬魚已成為一種熱門的脊椎動物模型，被大量地應用于再生醫學、臨床醫學、發育學、細胞生物學、神經科學、藥物學、遺傳學、環境毒理學及心理學等學科方面的研究[10-12]，特別是在再生醫學研究方面。與哺乳動物相比，斑馬魚具有繁殖能力強、體外受精、體外發育、生長發育快、體型小、胚胎及幼體透明且易于飼養等獨特優勢。更重要的是，斑馬魚基因與人類基因有高達87%的相似度，且在組織器官發育起源及發育過程等方面都具有較高的同源性，因此斑馬魚模型逐漸成為公認的一種人類疾病動物模型[13-15]。早在1980年人們就開始用斑馬魚進行骨骼特征的研究，且斑馬魚作為骨骼研究模式生物已被得到廣泛的認可[16]。目前，國內外研究團隊紛紛開展以斑馬魚為動物模型的骨疾病研究，并深入對多基因的復雜性骨疾病的病理機制和高通量藥物篩選進行更細致的探究。

就目前而言，對斑馬魚骨骼的研究多使用阿辛藍與茜素紅復合染色等有創的表征方法，然而這些方法不但繁瑣、耗時、耗材、耗力，更致命的是限制了許多科學研究進程，尤其在再生醫學研究方面[17,18]。相關研究亟需一種可以實現活體動態觀察骨骼發育與骨骼疾病發生發展的技術方法。光學相干層析成像(optical coherence tomography，OCT)是一種可進行非接觸式、非侵入性斷層成像的新型光學成像技術[19-21]，由于其利用了獨特的近紅外光散射成像原理，OCT成像深度遠高于共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡為代表的熒光成像技術。我們前期的研究表明，在透明度較高的瓊脂樣品中，1 325 nm波長的OCT系統具有高達約7 mm的三維成像能力，且不需要進行熒光標記[22]?；谝陨蟽烖c，我們構建了斑馬魚顱骨損傷再生模型，并利用OCT技術對該模型的顱骨損傷及顱骨再生過程進行活體、無損、動態成像，同時采用病理染色技術驗證OCT成像結果的準確性。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

本研究選取了13條野生型斑馬魚，其中3條斑馬魚作為正常組，10條斑馬魚作為顱骨缺損自然恢復組，分別編號并置于不同容器中培養。斑馬魚飼養環境為(28±0.5)℃的水體，給予的光照周期為14 h光照和10 h黑暗。

1.2 儀器

本研究采用的是頻域光學相干層析系統。頻域OCT系統結構如圖1所示。本OCT系統的光源是一個中心波長為840 nm、光譜帶寬為40 nm以上的超輻射發光二極管(InPhenix, 美國)。試驗采用一個焦長為 40 mm的掃描物鏡(大恒光電，中國)，每毫米1 200條刻線的全息光柵(wasatch photonics,美國)和2 048像素的線陣相機(凌云光電，中國)，用光纖耦合器將寬帶光纖耦合成為50/50的干涉儀。經過測量，本系統軸向分辨率約為8 μm，橫向分辨率約為12 μm，該系統對透明物體的成像深度可以達到4 mm左右，對肌肉等組織的成像深度可達2 mm左右[23,24]。本系統采用的掃描陣鏡(大族激光，中國)能以18 kHz/s的高成像速度快速采集信息，控制程序是基于C#編寫的，運行在臺式計算機(戴爾,中國)上，該臺計算機還負責數據的存儲和后期處理。

圖1 光學相干層析成像系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical coherence tomography system

1.3 試劑配制

配制質量濃度為0.01 g/mL的瓊脂溶液：稱取1 g的瓊脂粉(廣州環凱微生物科技公司)加入到100 mL的蒸餾水中，充分攪拌混勻，加熱至瓊脂粉完全溶解，倒入玻璃培養皿中，冷卻后形成瓊脂塊，用于固定被麻醉的斑馬魚。

配制質量濃度為0.01%的Tricaine溶液(麻醉劑)：Tricaine(西格瑪，A5040，美國)粉末以0.4%質量體積比溶于Holtfreter緩沖液中，即為25×儲備液，麻醉過程使用1×(0.01%)的稀釋溶液。

1.4 斑馬魚顱骨損傷再生模型的構建

在顱骨缺損造模方面，本研究采用的是一套自行研制的斑馬魚腦部立體定位儀。如圖2a、2b所示，定位儀使用光學精密滑臺作為運動框架，斑馬魚的夾持和電動鉆機的固定部分均使用3D打印方法進行制造。電動鉆機端可在YZ軸運動，夾魚臺端可在XR軸作旋轉運動，構成4軸的斑馬魚腦部定位儀。直流電機和精密鉆夾裝配使鉆頭的運動具有很高的同心度。鉆頭如圖2c、2d所示，直徑為200 μm，材質為鎢鋼，保證了其鋒利程度和硬度,且不會隨著使用時間增加而降低。

顱骨損傷斑馬魚操作如下：首先，將斑馬魚用質量濃度為0.01%的Tricaine溶液麻醉，再把斑馬魚腦部固定在定位儀上，然后，用同一鉆頭、相同轉速(2 000 r/min)對斑馬魚顱骨進行開孔操作?；诰_的立體定位裝置，顱骨創傷位置能保持較好的一致性。

1.5 顱骨缺損斑馬魚模型的自然恢復

開孔造模成功后，自然恢復組斑馬魚置于常規飼養水環境中，水更換周期約為2 d。試驗期間，給予斑馬魚適宜的進食量，保持自然恢復組所有魚的進食量一致，以排除進食量差異影響顱骨損傷再生速度。

1.6 OCT活體成像斑馬魚顱骨

首先，將已麻醉的斑馬魚用瓊脂塊固定，然后，把斑馬魚放置于OCT系統下，對斑馬魚顱骨損傷前后進行OCT活體成像。按試驗設計方案對骨缺損的斑馬魚顱骨再生情況進行活體監測，從而獲得顱骨修復情況的實時數據。

圖2 斑馬魚腦部立體定位儀Fig.2 Zebrafish stereotactic apparatus(a)裝置俯視圖；(b)裝置側視圖；(c)鉆頭照片；(d)鉆頭直徑(a)Vertical view of the equipment;(b)Lateral view of the equipment;(c)Photograph of drill;(d)Diameter of the drill

1.7 病理切片試驗

用冰浴法處死斑馬魚后將其放入Bouin氏液中固定，樣品固定24 h后再置于流水中沖洗24 h。隨后，將經過流水沖洗處理的斑馬魚樣品按照標準操作包埋成蠟塊，將包埋好的蠟塊固定于旋轉切片機(Leica，RM 2245，德國)上，切成薄片，厚度為4 μm。染色前將切片放入60 ℃恒溫箱中烤2 h，再用H&E染色標準操作處理切片。最后,利用數字病理玻片掃描儀(Leica，CS2，德國)對染色后的病理切片進行圖像采集。

1.8 測量和統計方法

本研究中顱骨缺損的直徑是使用專業軟件MATLAB 6.0在OCT圖像上測量獲取，進一步使用專業軟件Originpro-8對數據進行統計分析，每一個成像時間點處骨缺損直徑的數據都被用于分析斑馬魚顱骨恢復再生趨勢。

2 結果與分析

2.1 顱骨缺損模型建立過程中斑馬魚行為學表現

鉆孔試驗完成后，立即將鉆孔導致的顱骨缺損斑馬魚轉移到水中，所有斑馬魚模型都在造模后30 s內自行蘇醒，然后轉移到各自的飼養器中?；谡０唏R魚的OCT結果和精密的斑馬魚腦定位儀，本研究可以保證鉆孔操作不傷及腦組織。因此，顱骨缺損造模后的斑馬魚都沒有死亡，與正常組相比，顱骨損傷的斑馬魚游動無異常、活力無下降。

2.2 斑馬魚顱骨缺損前后的OCT活體成像結果及病理試驗結果

正常斑馬魚顱骨的OCT圖像如圖3a所示，該圖為頭部的冠狀面截圖。圖上可以清晰地看到綠色的虛線箭頭標記的連續帶狀結構，即為斑馬魚顱骨位置。由于骨質的高光散射特性，因此表現為較高的信號強度。覆蓋顱骨的是一層較軟的皮質，與哺乳動物相似，斑馬魚的皮質隨著年齡的增大會顯著增厚?；贠CT圖像結果可知，3月齡斑馬魚皮質厚度約為300 μm，顱骨厚度約為100 μm，這兩個數據為顱骨損傷試驗提供了指導。圖3b為對應區域的病理切片結果，可見顱骨的厚度與OCT圖像結果吻合得較好。由于制作病理切片過程中的脫水不可避免地會導致部分軟組織萎縮，導致病理結果中皮質的厚度小于OCT圖像中的厚度。圖3c為斑馬魚顱骨損傷后的OCT活體成像，這個結果清晰地顯示了損傷的位置，見綠色橢圓形虛線標記。進一步觀察可發現，由于鉆頭的貫穿動作，皮質和顱骨產生了分離間隙，有低密度的液體狀物質填充。圖3d為對應位置的病理切片，損傷的位置、大小都與OCT結果吻合，同時還顯示損傷區域有外溢血液填充，見藍色矩形虛線標記的區域。

圖3 斑馬魚顱骨損傷前后的OCT圖像與對應的病理切片Fig.3 OCT images of zebrafish skulls before and after injury as well as corresponding histological results(a)顱骨損傷前OCT圖；(b)顱骨損傷前病理結果；(c)顱骨損傷后OCT圖；(d)顱骨損傷后病理結果。綠色虛線箭頭表示顱骨，綠色虛線圓圈表示顱骨缺損位置，藍色的虛線矩形標記了開孔之后導致的血液滲漏(a)OCT image of normal skull;(b)Histological result of normal skull;(c)OCT image of injured skull;(d)Histological result of injured skull. The green dotted arrow indicates the skull, the green dotted circle shows that the location of the skull defect, and the blue dotted rectangle marks the blood leakage caused by the opening

2.3 OCT活體連續監測斑馬魚顱骨損傷后自然恢復過程

基于OCT技術無損傷、分辨率高和成像深度大的優點，我們進一步開展了斑馬魚顱骨損傷后再生過程的活體監控和評估性研究。OCT系統可以實時動態地觀察到，模型組斑馬魚顱骨從兩端相距甚遠逐漸恢復到幾近愈合狀態，斑馬魚顱骨損傷后自然恢復過程的代表性OCT結果如圖4所示。圖4a顯示的是顱骨缺損的初始階段，綠色虛線標注的是顱骨缺損的位置，經測量缺損直徑均約為218 μm，藍色箭頭標注的是開孔之后導致的血液滲漏。從圖4b中發現，經過2 d的恢復，顱骨的皮質層已經有明顯的恢復，然而顱骨處的外溢血仍然存在，顱骨缺損的直徑約為233 μm，有變大的趨勢。接下來的第5、9和11 天的OCT結果顯示，皮質已經完全恢復，顱骨的缺損也顯著減小，外溢血的圖像強度在圖4c所示的第5天達到了最大值，但隨后面積逐漸減小。到損傷后的14 d時，如圖4f所示，顱骨缺損基本恢復，剩余缺口直徑約為103 μm，外溢血完全消失，皮質完全恢復。

圖4 OCT活體監控斑馬魚顱骨損傷后的自然恢復過程Fig.4 OCT in vivo monitoring the natural recovery process of zebrafish skull after injury(a)顱骨損傷時；(b)損傷后2 d；(c)損傷后5 d；(d)損傷后9 d；(e)損傷后11 d；(f)損傷后14 d。綠色虛線標注的是顱骨缺損的位置，藍色箭頭標注的是開孔之后導致的血液滲漏(a)0 day;(b)2 days after injury;(c)5 days after injury;(d)9 days after injury;(e)11 days after injury;(f)14 days after injury. The green dotted line indicates the location of the skull defect, and the blue arrow shows the blood leakage caused by the opening

2.4 顱骨缺損自然修復21 d后的活體OCT和病理切片染色評估

顱骨損傷后修復是成骨細胞擴增和新骨架形成的過程，然而，現有成像技術由于存在分辨率低或成像深度不足等問題，難以實現這一過程的活體可視化。我們進一步對21 d自然恢復的顱骨缺損斑馬魚進行了活體OCT，成像結果如圖5所示。圖5a展示了大尺度的斑馬魚頭部OCT結果，可以發現骨缺損的直徑進一步減小，約為63 μm。圖5b對應的是病理切片結果，與OCT結果吻合較好。我們進一步把OCT圖像和病理圖像中的損失修復區域放大，如圖5c、5d所示?？梢郧逦匕l現，在骨損傷修復區域的邊界上有顯著的橋連狀結構，圖中用藍色箭頭標注，病理切片的結果顯而易見也存在這種結構。這一結果較好地反映了斑馬魚作為骨缺損模型的可行性以及OCT評估斑馬魚顱骨缺損模型的準確性。

2.5 定量分析斑馬魚顱骨缺損自然恢復效果

定量的數據更加有助于評價疾病模型和藥物療效，因此，我們從自然恢復組的每一個時間點的OCT圖像中將顱骨缺損直徑進行了測量，然后作圖分析，結果如圖6所示。自然恢復的顱骨缺損會在開始2 d的時候有變大的趨勢，隨后就逐漸變小?？梢杂^察到，斑馬魚在21 d內就已經能夠修復再生長度約為115 μm的骨組織。因此，我們根據數據分析，可以推測出斑馬魚的修復速率呈拋物線改變，顱骨損傷修復速率由慢到快后變慢，且機械性損傷后2周左右為修復期的巔峰。

圖5 顱骨損傷斑馬魚修復21 d后的OCT圖與其病理切片圖Fig.5 OCT and pathological results of the injured skull of zebrafish after 21 days(a)斑馬魚頭部OCT圖像；(b)斑馬魚頭部病理切片圖；(c)放大的損傷區域OCT圖像；(d)放大的損傷區域病理切片圖。綠色虛線圓圈表示損傷修復區域的位置，藍色箭頭表示放大后損傷修復的位置(a)OCT image of zebrafish head;(b)Histological image of zebrafish head;(c)Enlarged OCT image of the defect lesion;(d)Enlarged histological image of the defect lesion. The green dotted circle indicates the location of the damage repair area, and the blue arrow shows the location of damage repair after magnification

圖6 定量分析斑馬魚顱骨損傷修復過程Fig.6 Quantitative analysis of the repair process of skull injury in zebrafish

3 討論

斑馬魚與多數高等脊椎動物一樣，也存在軟骨內骨化和膜內骨化2種骨化方式[25]。其中，斑馬魚大部分的頭部骨骼是由軟骨內骨化發育產生的，且骨缺損愈合也是通過此方式[26]。斑馬魚骨骼發育過程和調控機制與哺乳動物一樣高度保守，所以基于斑馬魚骨骼模型的研究對于人類疾病的探討和研究具有重大價值與意義。目前，各個學科已成功構建了各自需要的斑馬魚骨骼疾病模型，特別是在骨骼再生能力方面的研究上。再生醫學是當今科學研究的前沿和熱點，在世界范圍內的發展日新月異，已成為最具轉化前景的研究領域之一，并極大地促進了其它相關領域共同邁進。為了應對我國骨骼疾病診治的巨大需求，我們利用斑馬魚作為骨骼再生模型積極地開展骨骼再生的研究。目前，研究斑馬魚骨骼模型的方法有經典的骨骼染色和醫學上的影像學檢測等手段。但現存的方法都存在自身的局限性，染色法極其繁瑣，耗時耗力。其他影像技術有些存在輻射損傷，有些只能對幼魚進行成像，存在成魚成像受限等問題。

本研究利用OCT相干成像技術對斑馬魚顱骨損傷模型的再生過程進行活體監測。由于光學特征是生物組織的重要物理參數，而OCT以無創的高分辨率揭示生物組織的光散射特征，具有無損和無標記的優點。本課題組的前期研究證實了OCT相干成像技術能夠有效地穿透成年斑馬魚的顱骨，對完整的大腦進行三維成像[27]。為了獲得斑馬魚顱骨的高分辨率圖像，本研究采用了基于840 nm的近紅外光的OCT系統進行試驗，并結合病理切片H&E染色結果，最后獲得的OCT結果與病理結果完全吻合。由此可證實，OCT技術在骨骼方面的監測完全具有可靠性。然而在成年斑馬魚的顱骨損傷再生過程的監測中，我們發現斑馬魚顱骨修復在早期不明顯，甚至存在損傷區增大的現象，大概于2周左右出現明顯修復，后期再次出現修復緩慢的現象。這種現象的發生是否與骨細胞的死亡及巨噬細胞的吞噬有關尚未清楚，在細胞生物學上具有一定的研究價值。而OCT技術的實時性、安全性和可靠性也決定了其在骨骼研究方面具有廣闊的應用前景，特別是在重大惡性疾病的演化過程研究方面具有明顯的研究優勢。

本論文介紹了一種基于自行研制的斑馬魚腦立體定位系統構建成年斑馬魚顱骨損傷模型的方法以及一種基于OCT技術從活體水平動態觀測斑馬魚骨損傷再生的策略。結果表明，斑馬魚的顱骨損傷后可以在較短的時間內再生，建模方式簡單，模型成功率高。且OCT技術能夠精準地活體評估骨骼再生過程，獲得的OCT圖像質量可以與病理結果相媲美。綜上所述，本論文開發的模型和OCT評估策略有較好的參考價值，有潛力推進骨疾病相關研究取得更大進展。