CLP膿毒血癥模型肝組織損傷芯片中差異基因及潛在通路分析

王永祥，張子建，劉如石，熊 力，劉 鍇，黃云鵬，陽 楊，陳 丹，文 宇*

(1.中南大學湘雅二醫院普外科， 長沙 410011； 2.湖南師范大學醫學院， 長沙 410006；3.珠海市人民醫院急診科， 珠海 519000)

膿毒血癥是一種可以導致嚴重的多器官功能障礙綜合征的致死性臨床疾病。雖然現代醫學在抗生素治療、呼吸機管理、復蘇策略和血糖維持等方面的快速發展大大提高了膿毒血癥的預防、診療水平，但嚴重的膿毒血癥仍是各臨床科室面臨的最棘手的問題之一[1]。膿毒血癥早期被簡單地定義為病原體引起的全身炎癥反應綜合征，但近年來膿毒血癥被認為是宿主對包含感染、創傷、應激在內的各類反應失調引起的器官功能障礙[2]。有資料顯示，多器官功能障礙在膿毒血癥患者并發癥中占40%～60%，普通抗感染治療和支持治療難以有效預防器官衰竭，因此治療效果不佳[3]。膿毒血癥可繼發于多種疾病，在腹部外科中，外科手術、肝膿腫、膽管炎、重癥胰腺炎等均可誘發炎癥反應過度活化、免疫系統紊亂、凝血功能障礙，繼而導致膿毒血癥[4-6]。因此，針對腹部外科的膿毒血癥防治尤為重要。也正是如此，脂多糖(1ipopolysacharide，LPS)或盲腸結扎穿刺術(cecal ligation and puncture,CLP)常被作為膿毒血癥經典模型來研究。本文旨在對大鼠、小鼠CLP膿毒血癥模型進行分析[7]，從模式動物的角度發現膿毒血癥造成肝臟組織損傷的潛在基因和調控網絡，為膿毒血癥肝損傷早期的精準診段和基因靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

本研究首先從NCBI-Gene Expression Omnibus數據庫(NCBI-GEO)下載2個原始微陣列數據集GSE1781，GSE510(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，共列入6例(GSM2405、GSM2406、GSM2407、GSM30472、GSM30473、GSM30474)CLP膿毒血癥模型和6例(GSM30469、GSM30470、GSM30471、GSM2402、GSM2403、GSM2404)假手術組數據[8,9]。接著使用R軟件(version 3.6.2)對高通量功能基因組表達的原始數據(小鼠Clontech Atlas Mouse cDNA Expression Array；大鼠Affymetrix Rat Expression 230A Array)進行標準化處理，通過limma包篩選了差異基因(different expression genes，DEGs)，將統計學上顯著的DEGs定義為P<0.05和[log2FC]>0.56作為截止標準，其中FC(fold change)為差異倍數。隨后基于基因本體論和通路富集，通過DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)和KEGG pathway(http：//www.genome.jp/kegg)數據庫分析篩選DEGs。為確定膿毒血癥肝損傷模型中功能、通路的潛在網絡關系，進一步使用蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)網絡，通過模塊分析整合了重要候選基因和通路。首先,使用在線數據庫String(http：//string-db.org)獲取DEGs編碼的蛋白質-蛋白質相互作用的網絡信息。其次，基于上述信息的關聯程度，使用Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用的關系網絡，并通過MCODE(molecular complex detection)模塊分析膿毒血癥中編碼蛋白質的候選DEGs的相互作用關系，使用網絡分析器插件來計算節點度，篩選具有重要生理調節功能的核心蛋白質和關鍵候選基因，為膿毒血癥早期診斷以及個體化的預防和治療提供更準確、實用的生物標記。

2 結果與分析

2.1 大鼠膿毒血癥肝組織損傷芯片差異基因分析

利用大鼠構建CLP膿毒血癥模型和假手術模型，留取對應肝組織進行差異基因芯片檢測。通過篩選獲得350個1.5倍及以上的上調表達基因(Log2FC≥0.56,P<0.05)，其中170個基因上調2倍及以上(Log2FC≥1,P<0.05)，17個基因(Lcn2,Ntf3,Pla2g2a,LOC100911545///A2m,Spink3,Lss,Spink3,Atpif1,Arpp21,Lss,Itgb3bp,Nfyb,Zfhx2,Acat2,Neb,Sqle,Slc1a2)上調4倍及以上(Log2FC≥2,P<0.05)。其中差異表達最顯著的是人中性粒細胞明膠酶(lipocalin 2,Lcn2)，其上調表達約達27倍(Log2FC=4.76,P<0.01)，為肝組織功能損傷的標志物之一[10,11]。在大鼠膿毒血癥肝組織下調表達1.5倍以上的基因有1 337個(Log2FC ≤-0.56,P<0.05)，其中822個基因下調2倍及以上(Log2FC≤-1,P<0.05)，231個基因下調4倍及以上(Log2FC≤-2,P<0.05)，6個基因(Tnnt1,Sv2a,Grip1,Pitx2,Rbbp9,Kitlg)下調16倍以上(Log2FC≤-4,P<0.05)。

圖1 大鼠CLP誘導的膿毒血癥肝組織差異表達基因聚類圖和火山圖Fig.1 Gene map of differentially expressed genes in liver tissue of sepsis induced by CLP in rats(a)聚類圖；(b)火山圖。|Log2FC|≥1,-Log10 P>4(a)The clustering diagram;(b)The volcano diagram. |Log2FC|≥1,-Log10 P>4

2.2 小鼠膿毒血癥肝組織損傷芯片差異基因分析

利用小鼠構建CLP膿毒血癥和假手術模型，留取對應肝組織進行差異基因芯片檢測。通過篩選獲得3 532個1.5倍及以上的上調表達基因(Log2FC≥0.56,P<0.05)，其中2 030個基因上調2倍及以上(Log2FC≥1,P<0.05)，669個基因上調4倍及以上(Log2FC≥2,P<0.05)，112個基因上調16倍以上(Log2FC≥4,P<0.05)，29個基因上調64倍以上(Log2FC≥6,P<0.05)，10個基因(A2m、Serpine1、Cd14、Slc10a6、Tifa、Il1rn、Cxcl1、Saa3、Cidec、Inhbb)上調128倍以上(Log2FC≥7,P<0.05),如由肝星狀細胞TLR4依賴性分泌的中性粒細胞趨化因子CXCL1介導肝臟對腸微生物群的反應[12]。在小鼠膿毒血癥肝組織下調表達1.5倍以上的基因有4 020個(Log2FC≤-0.56,P<0.05)，其中2 374個基因下調2倍及以上(Log2FC≤-1,P<0.05)，638個基因下調4倍及以上(Log2FC≤-2,P<0.05)，58個基因下調16倍以上(Log2FC≤-4,P<0.05)，8個基因 (Gck、Keg1、Nr0b2、Angptl8、Car3、Etnppl、Cyp7a1、Hsd3b3)下調64倍以上(Log2FC≤-6,P<0.05)。

2.3 大、小鼠膿毒血癥肝組織共同差異表達基因及其互作網絡

在大鼠和小鼠膿毒血癥肝組織中，對上述芯片結果的差異基因取交集，得到共同上調表達1.5倍以上(Log2FC≥0.56,P<0.05)的基因29個 (Timp1、Gpr146、Pgs1、Lcn2、Cux1、Ell2、Fabp5、Cflar、Rrp15、Nfyb、Mid1、Fam134b、Abhd13、Celf2、Flna、Orm1、Mtss1、Slc41a1、Gnat1、Jund、Synrg、S100a9、Gskip、Tra2b、Lbp、Cp、Pcm1、Srsf10、Gosr1)。84個基因(Nrep、Prkag2、Hsf4、Nudt8、Pxdn、Rbms2、Rasgrp2、Cryl1、Vezt、Man2b1、Gclm、Vapb、Map2k5、Whsc1、Zfand4、Mrps6、Pcbp4、Camta1、Gucy1b3、S1pr5、Acot4、Htatip2、Hlf、Asrgl1、Usp21、Eci1、Bdnf、Mettl7b、Tspan2、Kctd2、Kidins220、Aldh1a1、Tbc1d2b、Thap11、Aifm3、Lancl1、Eno3、Frmd4b、Osbpl2、Ghdc、Bmp6、Mn1、Lrpap1、Abcg8、Clock、Nr0b2、Cnpy4、Hadh、Aaed1、Tbx3、Mapk3、Cyb561a3、Tmem98、Lzts3、Slc8b1、Stat6、Atxn7l1、Tnxb、Zdhhc18、Foxo4、Plxnd1、Pla2g15、Bcl2l12、Kifap3、Fam162a、Pter、Ptk2b、Myh10、Zfp444、Mxi1、Cuedc2、Mmaa、Ccpg1os、Gclc、Atp2c1、Abcb4、1-Mar、Ankrd24、Edc3、Stox2、Coq9、Pik3r2、Rfxank、Vmac)下調表達1.5倍以上(Log2FC ≤-0.56,P<0.05)。為進一步分析差異蛋白質的功能，將這113個基因在String數據庫中進行了PPI網絡分析，并通過cytoscape軟件對上述PPI網絡進行進一步成分分析及可視化。

圖2 小鼠CLP誘導的膿毒血癥肝組織損傷差異表達基因聚類圖和火山圖Fig.2 Differentially expressed genes of sepsis-induced liver injury in mice with CLP (a)聚類圖；(b)火山圖。|Log2FC|≥1,-Log10 P>6(a)The clustering diagram;(b)The volcano diagram. |Log2FC|≥1,-Log10 P>6

表1 大鼠與小鼠CLP膿毒血癥模型肝組織芯片TOP5差異基因
Tab.1 TOP5 DEGs in liver tissue of rat and mouse CLP sepsis models

RegulationGene symbolOfficial full nameLocationSpeciesUpLcn2Lipocalin 2Chr3:11414189-11417534Rattus norvegicusUpNtf3Neurotrophin 3Chr4:158636883-158705886Rattus norvegicusUpPla2g2aPhospholipase A2 group IIAChr5:157282650-157285295Rattus norvegicusUpLOC100911545///A2mAlpha-2-macroglobulin-likeChr4:154422862-154473042Rattus norvegicusUpSpink3Serine peptidase inhibitor, Kazal type 3Chr18:38221919-38242092Rattus norvegicusUpA2mAlpha-2-macroglobulinChr6:121636165-121679238Mus musculusUpSerpine1Serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade E, member 1Chr5:137061504-137072272Mus musculusUpCd14CD14 antigenChr18:36725064-36726815Mus musculusUpSlc10a6Solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 6Chr5:103605711-103629403Mus musculusUpTifaTRAF-interacting protein with forkhead-associated domainChr3:127788875-127798394Mus musculusDownTnnt1Troponin T1, slow skeletal typeChr1:72889270-72899629Rattus norvegicusDownSv2aSynaptic vesicle glycoprotein 2aChr2:198321100-198336889Rattus norvegicusDownGrip1Glutamate receptor interacting protein 1Chr7:64672723-64854939Rattus norvegicusDownPitx2Paired-like homeodomain 2Ch2:233602732-233621059Rattus norvegicusDownRbbp9RB binding protein 9, serine hydrolaseChr3:138701579-138708332Rattus norvegicusDownGckGlucokinaseChr11:5900816-5950081Mus musculusDownKeg1Kidney expressed gene 1Chr19:12695790-12719902Mus musculusDownNr0b2Nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2Chr4:133553376-133556686Mus musculusDownAngptl8Angiopoietin-like 8Chr9:21835510-21837347Mus musculusDownCar3Carbonic anhydrase 3Chr3:14863538-14872381Mus musculus

圖3 CLP誘導的膿毒血癥肝組織損傷差異表達蛋白相互作用圖Fig.3 Interaction diagram of differentially expressed proteins in sepsis-induced liver tissue injury induced by CLP(a)所有差異基因的蛋白互作網絡；(b)核心互作網絡。紅色圓圈表示上調，藍色圓圈表示下調(a)The interaction network of all differential genes;(b)The core interaction gene.Red circles indicate up-regulation and blue circles indicate down-regulation

2.4 共同差異基因功能和通路分析

通過對上述共同差異基因從生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular component，CC)和KEGG通路4個角度的基因功能分析，發現20種生物過程、7類分子功能及5類細胞組分與膿毒血癥肝組織有潛在調控關系。其中，TOP3生物過程包含的基因數分別為8、7、7(表2)，且均與細胞轉錄功能相關；TOP3分子功能包含的基因數分別為5、5、3(表2)，分別與細胞信號轉導激活、核酸或ADP結合相關；TOP3細胞組分包含的基因數分別為13、7、4(表2)，分別與細胞核、內質網及高爾基體相關，這3類基因功能共同提示細胞轉錄的激活、修飾及能量供給在膿毒血癥肝組織中具有重要作用。

圖4 GO分析及KEGG通路分析Fig.4 GO analysis and KEGG pathway analysis(a)生物過程(GO-BP)；(b)分子功能(GO-MF)；(c)細胞組分(GO-CC)；(d)KEGG通路(a)Biological process(GO-BP);(b)Molecular function (GO-MF);(c)Cell component (GO-CC);(d)KEGG pathway

表2 膿毒血癥模型的肝組織基因芯片經GO和KEGG分析后TOP3功能和通路
Tab.2 TOP3 functions or pathway of liver tissue gene microarrays in sepsis model after GO and KEGG analysis

GeneFunction or pathwayBiological processCellular componentMolecular functionKEGG pathway Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoterNegative regulation of transcription from RNA polymerase II promoterTranscriptionNucleoplasmEndoplasmic reticulumMitochondrial inner membraneNucleotidebindingSignal transducer activityADP bindingMAPK signalingpathwayNeurotrophin signaling pathwayHIF-1 signaling pathwayStat6JundHsf4Foxo4Bcl2l12RfxankPik3r2Bmp6Stat6JundWhsc1Nr0b2Hsf4Cux1Bmp6Stat6Tbx3JundNr0b2HSF4Foxo4Cux1Stat6Cuedc2Htatip2Ptk2bUsp21VeztHsf4Foxo4HadhCux1RfxankThap11ClockPgs1PxdnAifm3Kifap3Tmem98GhdcLrpap1EcI1Aifm3Coq9HadhSrsf10Tra2bRbms2Celf2Gucy1b3Stat6Gnat1Ptk2bAtp2c1FlnaGclcPrkag2Myh10BdnfJundMapk3Rasgrp2FlnaMap2k5BdnfMapk3Kidins220Pik3r2Map2k5Mapk3Eno3Pik3r2Timp1

對上述共同差異基因從通路富集角度分析，發現共有10條通路與膿毒血癥肝組織關系密切，其中最主要的通路為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，這與PPI互作網絡分析結果的中心節點MAPK3一致，另外HIF-1、FoxO、乙型肝炎、血小板激活及膽汁分泌等通路調控也與膿毒血癥相關。

3 討論

在過去的幾十年中，許多基礎和臨床研究一直試圖揭示膿毒血癥形成和發展的新型、潛在機制，但是在世界范圍內，腹部外科領域的膿毒血癥的死亡率仍然居高不下，因為大多數研究一直集中在抗生素抗感染、免疫調節劑調控免疫細胞和炎癥因子上，但在多器官功能衰竭的器官本身是如何代謝、衰竭的機制上，認識還不夠清楚。為了進一步補充膿毒血癥診療上的潛在新機制，本研究整合了來自不同研究團隊的大鼠、小鼠芯片數據集，利用生物信息學方法對這些數據集進行了深入分析。在第一步中，雖然大鼠(圖1)與小鼠(圖2)非常相近，但并非完全同源，無法簡單的合并芯片中注釋的基因表達量結果，因此分別確定了兩組研究的DEGs，其中大鼠CLP膿毒血癥模型中有1 687個差異1.5倍以上、992個差異2倍以上的DEGs(170個上調2倍和822個下調2倍以上)；小鼠盲腸穿刺膿毒血癥模型中有7 552個差異1.5倍以上、4 404個差異2倍以上的DEGs(2 030個上調2倍和2 374個下調2倍以上)。在第二步中，將上述DEGs注釋取同源基因后獲取交集，并使用多種方法通過GO將DEGs分為3類(分子功能、生物過程和細胞成分組)，并分別聚類，得出潛在的差異基因最有可能影響的功能和通路。在第三步中，研究了DEGs蛋白質-蛋白質相互作用網絡復合體(圖3)，并從PPI網絡中濾出了最重要的模塊，鑒定出該模塊中，包含7個中心節點，這些基因與MAPK通路調控的各類細胞增殖[13]、代謝[14]、自噬[15]等過程密切相關。

通過綜合的生物信息學分析，已經確定了7個中心節點，并由這7個節點的蛋白潛在互作關系網絡組成了一個模塊(圖3b)，包括Lcn2、ORM1、CP、TIMP1、MAPK3、NROB2、JUND。其中，Lcn2和MAPK3位于變化最大的基因頂部，并且它們翻譯的蛋白生物學功能參與調節細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理或病理過程。MAPK 通路作為從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，已有諸多文獻表明在膿毒血癥中發揮著重要作用。膿毒血癥期間MAPK通路基因表達上調并持續存在，TLR4-TLR9-p38 MAPK-STAT3信號通路的激活有助于CLP誘導的膿毒血癥中miR-23b的產生[16]。miRNA介導的MAPK也被證實廣泛參與膿毒血癥調控中，miRNA-143與漿細胞瘤轉化遷移基因1 (plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)結合可上調MAPK-NF-κB途徑，從而調節膿毒血癥心臟功能并促進炎性因子的分泌[17]；膿毒血癥患者的血清中miR-135a明顯上調，miR-135a的上調可加重敗血癥誘導的炎癥和心肌功能障礙，SB203580或JSH-23(MAPK通路抑制劑)可逆轉此現象，證實p38 MAPK-NF-κB途徑介導了膿毒血癥的炎癥調控[18]。長鏈非編碼RNA也可發揮類似作用，Chen等[19]在膿毒血癥對心功能影響的研究中發現，轉移相關肺腺癌轉錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)通過激活p38 MAPK-NF-κB信號途徑誘導了CLP模型的心功能障礙和心肌炎癥，這是通過與miR-125b和p38 MAPK-NF-κB相互作用實現的。用葉黃素、類胡蘿卜素、蝦青素預處理小鼠原始巨噬細胞可以在體外抑制MAPK-NF-κB信號通路，并減弱LPS增加的炎癥因子。在LPS引起的膿毒血癥急性肺損傷的動物模型中，蝦青素的使用顯著提高了存活率并降低了肺損傷程度，并被證明在體內抑制了LPS誘導的炎癥因子增加、MAPK磷酸化和NF-κB活化[20]。

與本研究一致，一些研究也報道了膿毒血癥中Lcn2的重要作用。Lcn2蛋白屬于先天性免疫蛋白，其在體內鐵平衡、感染和炎癥中發揮作用[21]。有研究認為Lcn2亦屬于中性粒相關基因，這與本文中通路分析相符[22]。在神經系統中，Lcn2是LPS外圍給藥后中樞系統升高最多的蛋白質，通過Lcn2基因雙敲小鼠，研究者確定了Lcn2對LPS誘導炎癥模型具有抗炎保護作用，而這種保護途徑依賴于細胞因子和趨化因子信號轉導，核苷酸結合寡聚化域樣受體信號轉導以及Janus激酶信號轉導子和轉錄激活子等途徑[23]。對于消化系統，Lcn2被證明在無菌小鼠血清和糞便中的含量顯著降低，而通過口服管飼野生型小鼠的盲腸內含物可增加無菌小鼠血清Lcn2水平。反之,低表達Lcn2的小鼠表現出腸道細菌性營養不良，細菌負擔增加，革蘭氏陰性細菌的比例增加。這說明Lcn2本身可被微生物誘導，可能是維持微生物穩態的先決條件[24]。氧化應激也被認為是破壞腸源性膿毒血癥腸道屏障的主要因素之一， Lcn2被證明在體外對H2O2毒性具有保護作用[25]。此外，體內存在或使用Lcn2會引起炎癥性低鐵血癥和體內抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(SOD)和血紅素氧合酶1(HO-1)]的上調，以限制敗血癥期間鐵引起的氧化應激[26]。換句話說，Lcn2可以防止氧化應激并幫助減輕腸屏障損傷。Lcn2與MAPK3在本研究中是關鍵模塊中最重要的兩個基因，因此二者間可能有潛在聯系。在結直腸癌中，敲低Lcn2mRNA表達可通過p38 MAPK-CHOP依賴性途徑上調增強細胞對TRAIL的敏感性，增加抗腫瘤活性[27]。在肥胖和2型糖尿病中，Lcn2表達增加，這依賴于脂肪細胞中γ-干擾素(interferon γ,IFNγ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)的轉錄依賴性誘導。Zhao等[28]證實，MAPK(ERK 1/2)激活是IFNγ和TNFα誘導Lcn2蛋白表達所必需的，IFNγ和TNFα分別誘導克隆信號轉導與轉錄活化子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)和NF-κB促進Lcn2轉錄。從上述文獻來看，MAPK3可能作為上游分子，啟動并調控Lcn2蛋白的表達及功能。

膿毒血癥的的肝損傷特征涉及多種信號通路的基因和表觀遺傳調控，并導致肝組織中出現顯著的轉錄和翻譯差異。雖然本文的微陣列芯片結果只納入了基因轉錄水平差異，但此表達譜中仍可挖掘出膿毒血癥肝損傷的潛在特征。本研究只納入了基因表達量水平的研究分析，但根據前述，臨床癥狀表型的差異還應該考慮更多的分子調控因素，包括基因突變、DNA或RNA甲基化水平、非編碼RNA水平和微衛星變異等，這些因素都可能會導致或參與膿毒血癥的發生，并與預后密切相關。此外，簡單的盲腸穿孔模型造模大多為革蘭陰性菌類別的膿毒血癥，LPS是其主要致病毒素，因此一定程度上僅能代表此類別下疾病診療的研究結論。而來自革蘭陽性菌的脂磷壁酸(1ipoteichoic acid，LTA)和來自真菌的磷脂酰甘露聚糖(phospholipomannan，PLM)則會通過不同的方式激活并被免疫細胞識別[29]。免疫狀態也與膿毒血癥相關，Meakins等[30]首先發現部分膿毒血癥和外傷患者對通常的回憶抗原如麻疹和流行性腮腺炎病毒的遲發型超敏反應(delayed type hypersensitivity response，DHT)缺失，遲發型超敏反應缺失與死亡相關。但是，尚未完全了解膿毒血癥的每個亞型中的分子變化。

總之，本文通過使用多個芯片的數據進行生物信息學分析，確定了膿毒血癥中發生改變的部分基因，篩選了7個最關鍵的中樞基因，這些基因中最重要的MAPK3和Lcn2主要與MAPK通路、中性粒細胞激活通路和缺氧誘導因子通路等相關。這些發現有利于對膿毒血癥肝衰竭的病因和潛在分子機制的理解，上述基因和通路可以作為治療靶標用于后續研究。