生長分化因子11對2型糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞保護(hù)作用的研究

修賢杰 辛 恬 張 萍

佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江省佳木斯市 154000

2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)是臨床常見病和多發(fā)病，關(guān)于其研究受到了社會的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在T2DM患者病情發(fā)展過程中，進(jìn)行性β細(xì)胞數(shù)量的減少及其功能紊亂扮演著非常重要的角色，是造成病情惡化的重要病機之一[1]。生長分化因子11(Growth differentiation factor 11，GDF-11)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β家族不可缺少的一員，對人體器官的作用集中表現(xiàn)在調(diào)控作用方面[2]。近年來，大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，外源性補充GDF-11能夠有效改善多種與年齡相關(guān)的器官衰老表現(xiàn)，常見的如心肌肥厚、骨骼及損傷等[3]。另有研究報道顯示，對于老齡小鼠心臟的損傷，給予GDF-11能夠有效促進(jìn)損傷修復(fù)[4]。目前，臨床對于GDF-11作用于小鼠血脂代謝紊亂的報道較多，但是關(guān)于對小鼠胰島β細(xì)胞的作用機制研究相對較少，外源性補充GDF-11對T2DM小鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用如何仍舊值得探究。為此，本研究以T2DM小鼠作為研究對象展開相關(guān)分析，現(xiàn)將情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡的SPF級雄性C57BL/6J野生型小鼠共30只，體重15～20g，平均體重(17.45±3.26)g，均購于常州卡文斯實驗動物有限公司。高脂飼料、鏈脲佐菌素(STZ)分別購于北京華阜康生物科技股份有限公司、美國Sigma公司。人重組GDF-11蛋白購于美國Pepro Tech公司。其他材料主要為實驗操作所需的材料，如小鼠胰島素、ELISA試劑盒、血糖儀及試紙、血脂生化指標(biāo)檢測試劑盒、糖化血紅蛋白(HbA1c)試劑盒、兔抗人胰升血糖素抗體(1∶100，美國Ab-cam公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 GDF-11的注射：將30只小鼠分為3組，其中采用GDF-11干預(yù)的視為干預(yù)組，余下10只未采用GDF-11干預(yù)視為未干預(yù)組，另外10只不進(jìn)行造模視為正常對照組。正常對照組實施普通飼料喂養(yǎng)，干預(yù)組和未干預(yù)組給予高脂飼料喂養(yǎng)，均持續(xù)喂養(yǎng)4周。4周后，對干預(yù)組一次性腹腔注射STZ(100mg/kg)，未干預(yù)組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射14d后，剪尾測定各組小鼠血糖水平，連續(xù)2d血糖≥13.9mmol/L的小鼠被視為造模成功。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測：小鼠禁食12h，腹腔注射60mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，打開腹腔，后腔靜脈采血，離心后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清胰島素、胰升糖素、TG、TC、FFA、HbA1c水平,按照相應(yīng)說明書進(jìn)行操作。剝離完整胰腺，用液氮保存，用于測定組織中胰島素及胰升糖素含量。

1.2.3 小鼠胰島分離：小鼠麻醉并剖腹，利用手術(shù)鉗將膽管末端予以夾閉，在肝管匯合處(左、右匯合處)，對膽總管行穿刺處理，將膠原酶溶液2.3ml緩慢注射其中，其目的是促使胰腺能夠均勻膨脹，而后對胰腺進(jìn)行迅速分離，并置于備好的Ⅴ型膠原酶的 Hank’s平衡液中消化。

1.2.4 RT-PCR檢測：采用Trizol試劑提取胰島總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對肌腱膜的纖維肉瘤腫瘤基因同系物A(MafA)、胰島胰腺十二指腸同源盒1(Pdx-1)、Nkx6轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)1(Nkx6.1)等β細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組生化指標(biāo)水平比較 干預(yù)4周后，與正常對照組相比，干預(yù)組體重、攝食量、FBG、HbA1c和血脂指標(biāo)水平更高(P<0.05)；與未干預(yù)組相比，干預(yù)組體重、攝食量、FBG、HbA1c和血脂指標(biāo)水平明顯更低(P<0.05)。詳情如表1所示。

表1 各組生化指標(biāo)水平比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與未干預(yù)組相比，△P<0.05。

2.2 GDF-11上調(diào)T2DM小鼠胰島β細(xì)胞功能重要基因表達(dá) 干預(yù)組Pdx-1、MafA、Nkx6.1的表達(dá)明顯高于未干預(yù)組(P<0.05)，且與正常對照組差異不明顯(P>0.05)，詳情如表2所示。

表2 各組GDF-11對胰島β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響

注：與正常對照組相比，*P>0.05；與未干預(yù)組相比，△P<0.05。

3 討論

T2DM在臨床上較為常見，屬于代謝性疾病的一種，具有較高的發(fā)病率，近年來受到人口老齡化趨勢加劇、人們生活和工作方式以及飲食結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變等因素影響，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[5]。對于T2DM患者而言，隨著病情的不斷進(jìn)展，若血糖控制不理想可導(dǎo)致病情惡化，引發(fā)相關(guān)并發(fā)癥，如糖尿病足、糖尿病腎病等，甚至造成患者死亡，嚴(yán)重威脅到了人們的健康乃至生命安全[6]。因此，加強對T2DM相關(guān)發(fā)病機制的研究至關(guān)重要。

在T2DM的發(fā)生和發(fā)展過程中，胰島素扮演著非常重要的角色，是T2DM患者病情改善和加重的重要風(fēng)向標(biāo)[7]。研究表明[8]，在胚胎發(fā)育過程中，對于胰島素的成熟及機體代謝的改善，GDF-11均可在其中發(fā)揮重要的作用，而這臨床相關(guān)研究也比較常見，但是關(guān)于GDF-11對成年胰島β細(xì)胞的作用研究很少。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者機體循環(huán)中，GDF-11水平與不良事件(如并發(fā)癥、死亡等)的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)[8]。另有關(guān)于心血管疾病的研究認(rèn)為，患者的GDF-11水平與糖尿病發(fā)生的風(fēng)險呈正相關(guān)[9-11]。本研究結(jié)果顯示，補充循環(huán)中的GDF-11對糖尿病小鼠FBG及HbA1c有明顯的降低作用，可促進(jìn)糖耐量的改善，但是進(jìn)一步對體重和攝食量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)隨著GDF-11的變化并無明顯改變，提示GDF-11的降糖作用不依賴于體重及食欲的改變。對于正常小鼠的血糖HbA1c及糖耐量而言，GDF-11的變化對其造成的影響并不明顯，表明GDF-11對正常小鼠作用是安全的，這與臨床相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。在李歡等[12-13]學(xué)者的研究中，針對GDF-11對胰島β細(xì)胞的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF-11可改善胰島β細(xì)胞功能及維持β細(xì)胞含量，進(jìn)而延緩糖尿病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞數(shù)量對于維持機體正常糖代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義[14]。在糖尿病中，除了β細(xì)胞功能紊亂外，β細(xì)胞數(shù)量下降也是導(dǎo)致高血糖的主要原因。因此，找到維持β細(xì)胞數(shù)量的方法對于延緩糖尿病進(jìn)展十分重要[15]。本實驗中，GDF-11不僅可以修復(fù)正常胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且可能通過維持β細(xì)胞含量改善高血糖，但是由于相關(guān)方面的研究報道并不多見，本研究結(jié)果得出該結(jié)論的可信度仍舊有待提升，這需后續(xù)研究的進(jìn)一步挖掘和深化。

綜上所述，GDF-11對糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，其作用機制可能與降低血脂，抑制胰升血糖素的釋放，上調(diào)重要β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而改善β細(xì)胞功能及維持β細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。