HPLC檢測不同配比三七-黃連藥對中3種成分的溶出率△

陳雪平，郭麗娜，王單單，田會東，裴媛，王瑞*

1.漯河市中心醫院 藥學部，河南 漯河 462300；2.武漢大學 基礎醫學院，湖北 武漢 430000

三七是五加科人參屬植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen.的干燥根和根莖，性甘,微苦。在《本草新編》中被稱作“止血之神藥”；其化學成分主要是達瑪烷型皂苷、黃酮類、氨基酸等，如人參二醇型皂苷、原人參三醇型皂苷三七[1]。三七具有散瘀止血、消腫定痛的生物活性，臨床上主要用于治療咯血、吐血、崩漏、外傷出血、跌撲腫痛等[2]。黃連CoptischinensisFranch.是毛茛科黃連屬多年生草本植物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理作用，臨床用于黃疸、高熱神昏等[2]。三七與黃連是臨床上常用的藥對之一，我國傳統的以三七、黃連為主藥的中藥復方制劑有中藥復方三七貝連蜜糊[3]、苦參黃連湯[4]、復方三七飲[5]、三七芪連湯[6]等。藥對是中藥復方最常用的配伍形式，組成簡單卻具備中藥復方配伍的基本特點，是以中醫藥理論為指導，并經過長期臨床實踐證明行之有效和有一定組合法度的兩對相對固定中藥的配對，通過配伍組合發揮協同增效或配伍減毒等作用[7]。雖然三七-黃連藥對在臨床上廣泛應用，但目前兩者的配伍比例鮮有報道。研究表明藥對的不同配比對有效成分的溶出率有較大影響[8-11]。三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1是三七總皂苷的主要活性成分，檢測三者的含量對三七-黃連藥對的質量評價具有重要意義[12]。因此，本實驗設計了9個三七-黃連的配比，研究不同配比下三七-黃連藥對中主要活性成分的溶出率變化規律，并從化學成分視角探討最佳配比，為后續研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

LC-20A島津高效液相色譜儀、DGU-20A3R在線脫氣系統、全波長色譜工作站、SPD-M20A光電二極管陣列紫外-可見光檢測器、SIL-20AC自動進樣器、CT0-20AC柱溫箱(日本島津公司)；臺式高速離心機(16K，珠海黑馬醫學儀器有限公司)；超聲波清洗器(SB25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司)；電子分子天平(JY，上海衡平儀器儀表廠)；純水儀(Milli-Q，美國Millipore公司)。

三七皂苷R1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110745-201820，純度：93.1%)；人參皂苷Rb1對照品(斯坦福分析化學公司，批號：GSB-107939，純度：98.34%)；人參皂苷Rg1對照品(斯坦福分析化學公司，批號：GSB-705891，純度：99.87%)。三七和黃連購自安徽。經漯河市中心醫院藥學部于曉濤主任鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，線性梯度洗脫(0～25 min，2%～20%A；25～50 min，20%～45%A；50～60 min，45%～70%A；60～65 min，70%～70%A；65～70 min，70%～2%A)；流量為1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長203 nm；進樣體積10 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1供試品樣品制備 三七和黃連按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、4∶1、3∶1、2∶1、0∶1共9種不同比例分別精密稱取2味中藥，每個比例均為10 g，于500 mL圓底燒瓶中加20倍量水，浸泡2 h。加熱回流提取1 h，過濾，轉移到離心管中，99×g離心10 min，取上清液置于250 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。精密吸取2 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存備用。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取適量，水溶解定容于1 mL容量瓶中，搖勻，制成的混合對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存，備用。

2.2.3HPLC檢測 分別取上述制備的樣品各10 μL，注入HPLC色譜儀，按2.1項下的色譜條件檢測，色譜圖見圖1。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取2.2.2項下的混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，水定容，搖勻。精密吸取10 μL注入HPLC色譜儀，在2.1項下的色譜條件檢測。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的線性回歸方程，分別是Y=3 944 200X+25 079.6(0.40～0.18 mg·mL-1，r=0.999 6)、Y=5 381 900X+185 331.0(0.1～0.68 mg·mL-1,r=0.999 6)和Y=4 117 930X+149 098.0(0.16～0.70 mg·mL-1,r=0.999 6)。r均大于0.999，表明線性方程在檢測范圍內線性關系良好。

注：A.對照品；B.黃連；C.三七；D.三七-黃連配伍比為1∶1；E.三七-黃連配伍比為1∶2；F.三七-黃連配伍比為1∶3；G.三七-黃連配伍比為1∶4；H.三七-黃連配伍比為2∶1；I.三七-黃連配伍比為3∶1；J.三七-黃連配伍比為4∶1；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1。圖1 三七-黃連不同配伍比的HPLC圖

2.4 系統適用性

取上述制備的混合對照品溶液的中間濃度，按2.1項下的色譜條件檢測，計算理論塔板數(N)，N=16(tR/w)2(tR是保留時間，w是化合物基線的峰寬)，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的理論塔板數分別是125 685、105 813、46 178；拖尾因子(T)，T=w0.05/2 d(w是化合物基線的峰寬，d是峰前沿到峰頂點之間的距離)，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的拖尾因子分別是1.041、1.006、0.970，3個化合物的拖尾因子都在0.95～1.05，符合2015年版《中華人民共和國藥典》規定。取中間濃度的混合對照品溶液，用水稀釋到適當濃度，按2.1項下的色譜條件檢測，當信噪比分別為3和10時，此時對應化合物的濃度分別為檢測下限和定量下限，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的檢測下限分別是0.860、0.052、2.037 μg，定量下限分別是2.860、0.174、6.790 μg，3個化合物的濃度都大于定量下限，表明該方法系統適用性良好。

2.5 精密度

日內精密度：取上述制備的混合對照品溶液高、中、低3個濃度，每個樣品連續進樣6次，在2.1項下的色譜條件檢測，計算連續6次的RSD；日間精密度：同樣取混合對照品溶液的高、中、低3個濃度，每個樣品每天連續進樣2次，連續進樣3 d，在2.1項下的色譜條件檢測，計算6次進樣的RSD，如表1所示，表明精密度良好。

2.6 穩定性

取上述制備的混合對照品溶液高、中、低3個濃度，分別在0、2、4、8、16、24 h通過2.1項下的色譜條件檢測，計算RSD，如表1所示，表明供試品溶液24 h穩定。

2.7 重復性

按2.2.1項下方法制備三七-黃連質量比為1∶1的供試品溶液6份，在2.1項下的色譜條件檢測。計算3份供試品溶液的平均含量的RSD，結果如表1所示，表明該方法重復性較好。

2.8 加樣回收率

精密量取三七-黃連質量比為1∶1的供試品溶液6份，每份1 mL，分別加入已知量的對照品，制備供試品溶液，在2.1項下的色譜條件檢測，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 HPLC檢測三七-黃連藥對中3種成分含量的方法學考察(n=6)

2.9 結果

2.9.1有效成分溶出率 按2.1項下檢測的9個三七-黃連不同配比的含量，計算有效成分溶出率，公式如下，結果見圖2～4和表2。

單一成分的溶出率=(該化合物在提取物中的含量/
該化合物對應生藥材的取樣量)×100%

(1)

三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1溶出率隨不同比例的變化趨勢分別見圖2～4。由圖2可知當三七-黃連配伍比為1∶4時，三七皂苷R1的溶出率最好，當三七-黃連配伍比為1∶2時，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的溶出率最好。

圖2 不同配伍比例三七-黃連藥對中三七皂苷R1溶出率變化

圖3 不同配伍比例三七-黃連藥對中人參皂苷Rg1溶出率變化

圖4 不同配伍比例三七-黃連藥對中人參皂苷Rb1溶出率變化

表2 三七-黃連不同配伍比例下3個成分的溶出率(n=3) %

2.9.2最優配比結果 以三七-黃連藥對中3個有效成分為考察指標，采用“歸一化法”處理數據，通過Hassan法進行數學轉化，計算各指標的“歸一值”，公式如下[13]：

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(2)

再通過各指標的“歸一值”，得到總“歸一值”(A)，公式如下[14-15]：

A=(d1×d2……×dn)1/n

(3)

結果如表所示。由表3可知，當三七-黃連配伍比為1∶4時，3種成分的溶出率最好，配伍比為3∶1時，三者的溶出率最差。

表3 三七-黃連不同配伍比例下3個成分的總評歸一值

3 討論

研究結果顯示，不同配伍比例的三七-黃連藥對對有效成分的溶出影響較大。其中R1的溶出率隨黃連比例的升高而增加，Rg1和Rb1的溶出率隨黃連的比例升高先增加后降低，當三七-黃連配伍比為1∶2時，兩者的溶出率最大。本研究選取的3個成分屬于三七-黃連藥對的主要藥效物質，被《中華人民共和國藥典》列為對應藥材的質量控制性指標。因此，以三者的溶出率為指標進行最優配比關系考察具有一定的代表性。通過計算三七-黃連不同配比條件下3個成分溶出率的總評歸一值，發現當三七-黃連比例為1∶4時，三者的總溶出率最大，為3∶1時有成效成分的總溶出率最差。

本研究從化學成分的角度對中藥藥對三七-黃連最佳配比關系進行了研究，在以后的科研工作中，將從藥效學的視角做進一步的探討，為三七-黃連藥對的最佳配伍比例的確定提供參考。