石油降解菌的復配及降解效果評價*

李小康，魚 濤，李 紅，杜明明，屈撐囤，2

（1.西安石油大學陜西省油氣田環境污染控制技術與儲層保護重點實驗室，陜西西安 710065；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206）

0 前言

石油烴化合物作為不同行業的主要能源和材料，由于用途較廣、使用量大，導致石油類物質每年大量流入土壤和水體中，對生態環境產生負面影響［1-2］。石油物質引起污染的途徑很多，主要包括石油大規模生產、運輸、煉制、航運活動、意外溢油等［3］。若不及時治理，這些污染會不斷向周圍環境擴散，并在新的環境中積累而達到較高的污染水平，給環境中的生命構成直接或間接的健康危害［4-5］。石油污染物被列為污染廣泛的有毒化合物［6］。近年來，對石油污染物的控制已成為環境保護的重要問題［7］。因此，以環保和健康為宗旨清潔這些石油污染是非常必要的，廣大學者已研究并總結出一系列治理污染的技術［8］。相比于物理和化學的修復方法，生物處理是一種費用低、操作簡單、環境友好的處理方法［9-10］，不會對環境產生有害影響。但由于微生物修復的效率普遍較低，嚴重阻礙了微生物修復技術的實際應用，同時，降解石油污染的過程復雜多樣，不同菌株對原油的降解效果也各有差異，不同的環境條件和菌株間的相互作用也會影響原油的降解效果［11-12］。本文主要針對陜西定邊油田附近石油污染土壤的修復構建高效的混合菌群，分析了它們的降解能力和降解過程中菌劑的組合配比，找尋提高它們降解能力的方法，為后續工程實踐提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

含菌土壤：挖掘陜西定邊與靖邊油田附近的原油污染土壤表層10數20 cm的土壤，經自然風干，破碎研磨、混勻、過0.85 mm 篩后密封，用于降解菌的分離與富集。

營養原油培養基：將4.8 g K2HPO4·3H2O、1 g（NH4）2SO4、1.5 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O，0.5 g Na3C6H5O7·2H2O、0.1 g酵母粉和0.002 g CaCl2·2H2O 逐一加入超純水中進行溶解，定容到1000 mL，用2 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調節pH 為7.0數7.2，制成營養培養基。取營養培養基100 mL，定量加入0.2 g原油（含飽和烴81.58%、芳香烴7.86%、膠質7.26%、瀝青質1.06%，回收率97.76%），將培養基置于121℃下高壓滅菌25 min。

LB 培養基：將10 g 蛋白胨、10 g NaCl 和5 g 酵母浸粉加入1000 mL的超純水中進行溶解，制備LB培養基。

DNP-9272A型恒溫培養箱，常州恒隆儀器有限公司；LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；OIL-460型紅外分光測油儀，北京華夏科創儀器技術有限公司；JYW-200A 型表面張力測定儀，承德金和儀器制造有限公司；SPX-150 GH型隔水培養箱，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石油降解菌株的篩選與分離

將2.0 g預處理后的含菌土樣加入100 mL的含2 g/L 原油的營養原油培養基中，在150 r/min、30℃的恒溫震蕩培養箱培養24 h，轉移到另一個新鮮營養原油培養基中振蕩富集培養7 d，重復4次。使用稀釋涂布平板法培養單個菌落，培養2數4 d 左右，挑取菌落特征明顯的單一菌落進行編號保存。

1.2.2 生理生化特性鑒定及分子生物學鑒定

根據文獻［13-14］提供的方法對已保存菌株進行生理生化和形貌的分析鑒定。對純化的細菌進行16S rDNA 的聚合酶鏈反應擴增，建立和表征不同種屬的細菌種類。利用通用引物為模板對菌株 進行16S rRNA 基因的擴增，通用引物為［15］：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492 R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。

具體反應體系為：Template（基因組DNA 20數50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mM）1 μL，酶0.2 μL，F（10 uM）0.5 μL，R（10 uM）0.5 μL，加雙蒸H2O 至25 μL，總反應體系共30.2 uL。PCR 擴增條件為：預變性94℃4 min；30 cycle 94℃45 sec，55℃45 sec，72℃1 min；72℃延伸10 min。將擴增產物進行測序并在NCBI進行比對分析，并構建系統發育樹。

1.2.3 菌株的生長特性分析

向12 支試管中分別加入5 mL 的LB 液體培養基，在121℃下滅菌30 min，使用接種環接種篩選的石油降解菌（600 nm波長處的吸光度值OD600=0.5），并標注編號，放入恒溫振蕩培養箱在35℃、180 r/min條件下培養，每6 h取樣1次，使用可見分光光度法測定吸光度值，并求出OD600值［16］。使用原油培養基探究菌株以石油為碳源情況下的生長狀況，由于培養基中原油在6 h 左右會被細菌乳化，故不能采用分光光度法測量細菌的OD600值，選用平板涂布法［17］測定不同時間下的菌數。

1.2.4 原油降解率的測定

在100 mL 的原油培養基中加入0.2 g 原油，滅菌后繼續加入3%接種量的純化菌液（OD600=0.6），并設置2個平行樣和空白對照，在37℃、180 r/min的恒溫震蕩培養箱中振蕩培養7 d 后，使用四氯化碳萃取剩余的原油，使用紅外測油儀測定剩余的總石油烴的量。利用所測數據按照式（1）計算原油降解率：

其中，ν—原油降解率；c1—無菌對照樣品中原油的總烴類含量，mg/L；c2—接菌樣品中原油的總烴類含量，mg/L。

1.2.5 單菌降解殘余烴類組成分析

用CH2Cl2萃取細菌降解7 d 后的原油培養基，使用無水Na2SO4除去萃取液中殘余水分后進行GC-MS分析。GC-MS分析條件：色譜柱為DB-5MS毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度250℃，載氣為高純度He氣，流速1 mL/min；在80℃下保持5 min，然后以6℃/min升溫速率升至180℃，保持2 min，再以10℃/min 的升溫速率升至300℃，保持10 min；分流比為10∶1。

1.2.6 復配菌株對原油降解效果分析

如表1所示，采用A-3、D-5、C-2這3株原油降解菌株進行正交試驗，培養基中原油濃度為2 g/L，在溫度35℃、搖床轉速180 r/min 下降解反應7 d。通過正交試驗和SPSS 主體間效應分析，探究復合菌加量對原油降解率的影響，找到最佳復配比例。

表1 正交實驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

菌株經過多次的轉接、篩選、純化后，分離出5株對原油降解作用明顯且活性較高的石油降解菌D-5、C-2、A-3、D-3、D-1，其生理生化特性如表2 所示。使用MEGA7 軟件對A-3、D-5、C-2 的基因序列進行系統發育樹構建，結果如圖1所示。

2.2 菌株的生長狀況

分離的不動桿菌D-5、無色桿菌C-2、銅綠假單胞菌A-3、黏質沙雷氏菌屬D-3、纖維單胞菌D-1 在LB培養基的生長曲線如圖2所示。分離的5種菌株生長狀況各有差異，其中A-3、C-2的生長狀況最好，對數期菌株增長較快，A-3、C-2和D-5分別在25、30和30 h 左右達到穩定期。A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的混合菌群E 在LB 培養基的生長曲線也見圖2。混合菌E呈現S型增長趨勢，細菌生長量也達到較高水平，在LB 培養基中45 h 時OD600值達到1.94，在原油培養基中菌數達到4.3×1015個/mL。Cornforth D M等［18］研究表明，當混合菌生長曲線為S 型增長時，菌株之間將不存在拮抗作用。因此可以將A-3、C-2、D-5這3株細菌作為混合菌降解石油污染物。D-3、D-1 的生長量較低，這可能是由于培養基本身不適合該細菌的生長繁殖。張東升等［19］研究認為，細菌在不同培養基中的適應能力和生長狀況各有不同，有些培養基還會抑制微生物自身生長代謝，降低微生物活性。分離的D-5、C-2、A-3、D-3、D-1 等5 種菌株和A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的菌混合菌群E在原油培養基中的生長曲線如圖3所示。混合菌群E在培養基中依然表現出較高的細菌生長量，D-5、A-3 也呈現較好增長的趨勢，C-2 相比于D-3、A-1 生長趨勢也較好。綜合可得，A-3、C-2、D-5 這3 株細菌無論是在獨立條件還是混合條件下，在原油中均表現出很高的生物活性，可以用作治理石油污染的修復菌劑。

表2 分離菌株形態與生理生化鑒定

圖1 菌株16S rDNA基因序列發育樹

圖2 菌株在LB培養基中的生長曲線

圖3 菌株在原油培養基中的生長曲線

2.3 細菌對原油的降解效果

細菌D-5、C-2、A-3、D-1和混合菌群E對原油的降解率如圖4所示。由圖4可見，D-5和A-3對原油的降解效率均達到60%以上，C-2 對原油的降解率也達到39.36%。D-3由于降解過程中會將水中分散的原油聚集成為不溶于水和有機溶劑的團狀物質，無法使用紅外測油儀測定降解率，夾出水中團塊物質后水中含油量幾乎為0。分析可能是細菌自身分泌的一些胞外物質對原油產生了聚集包覆作用［20］。混合菌群E 對石油的降解率最高，可能是微生物之間的協同作用改善了原油的疏水性和乳化性，增強了微生物對原油的利用效率［21］，具體情況有待進一步研究。結合圖3 可知，混合菌在相同培養環境下的生長量比其它菌株的略高，也反映出微生物對石油的利用率增強。

圖4 各菌株7 d后對原油的降解率

2.4 殘烴的GC-MS分析

單菌（OD600=0.6）和混合菌E 在2 g/L 石油含量的無機鹽培養基中反應7 d 后，萃取剩余油相進行GC-MS 分析，結果如圖5 所示。由圖5 可知，A-3、D-5 和混合菌E 可以高效地降解原油組分中的C16、C17、C18、C19、C21、C44等烴類，且都表現出較強的石油降解能力；而D-1、C-2降解石油組分的能力相對較低。

2.5 菌株的乳化能力和表面活性劑對菌株降解能力的影響

篩選產表面活性劑菌株的方法較多，不同菌株分泌的表面活性劑種類不同，單一方法不能準確測定菌株分泌表面活性劑的能力［22-23］。表3 為血平板乳化實驗和菌株降解后培養液表面張力的測定結果。將5種菌株接種到血平板上，在20℃下經過2 d的恒溫培養，只有A-3、D-5 生成了大小不同的透明乳化圈，且發酵液的表面張力的差異不大。可能是由于血平板培養基不能很好地促進菌株生成表面活性劑。其他3 種菌株均未產生透明的乳化圈，發酵液表面張力基本接近空白培養基的表面張力，因此菌株對培養基中原油的降解率低［24］。

圖5 各菌株降解原油后剩余組分的GC-MS分析

向培養基中加入4 mL的質量濃度為10 g/L的表面活性劑Tween 80，降解反應7 d后單菌對原油的降解率如表4所示。結果表明，向培養基中加入表面活性劑Tween 80后，5株細菌對原油的降解率均有所提高，其中C-2對原油的降解率提升最高，達到70.84%。

表3 各菌株分泌表面活性劑的能力

表4 各菌株在有Tween80的情況下對原油的降解率

2.6 高效降解菌群的復配

不同菌株降解原油中各組分物質的效率和方式存在差異，菌株之間也會相互影響，當菌株之間相容性較高或存在協同關系時，混合菌群能發揮最大的降解作用。研究表明，混合菌株投加比例合適時，會進一步提高細菌的降解效率［25-26］。D-5、C-2和A-3按不同比例混合的混合菌對原油的降解率見表5，SPSS主體間效應的檢驗結果分析見表6。由表5可知，混合菌群在D-5、C-2 和A-3 之間的最佳接種比例5∶1∶5時對石油的降解效果最好。結合表6主體間效應檢驗結果的Sig 值（0.05＜D-5＜A-3＜C-2，即0.05＜0.129＜0.354＜0.502）來看，3株菌對原油降解率均不產生顯著性影響，但混合菌群能有效地降解原油，說明各菌群對石油的降解均起到一定作用，其中D-5 對石油污染物的降解效果影響最大，其次是A-3、C-2。通過實驗發現，在最佳條件（溫度35℃、pH 7.5、搖床轉速180 r/min、菌液加量6 mL）下，最佳接種比例的混合菌群在原油培養基中對原油的降解率達到74.18%。

表5 菌株復配正交試驗與極差分析

表6 SPSS主體間效應的檢驗結果分析

2.7 Tween80加量對菌株降解能力的影響

通過以上探究發現，加入Tween80 可以明顯提升菌株對原油降解能力。表面活性劑對原油有較強的乳化作用，適量加入會提高微生物自身的活性，增強對原油的降解，但加入過量的表面活性劑會對微生物產生毒害作用［27］。研究表明［28-29］，投加的表面活性劑未達到臨界膠束濃度cmc 前，疏水性有機化合物的溶解性不能得到顯著提升。通過“拉環法”測定了加有不同量的Tween80 原油培養基的表面張力，結果見圖6。經測Tween80 在原油培養基中的cmc值為30 mg/L，此時培養基的表面張力趨于穩定。為了進一步提高復配菌株對原油的降解效率，考察了不同Tween 80加量下復配菌株對原油的降解速率，結果見圖7。當培養基中Tween 80 加量為30 mg/L（1 cmc）時，降解7 d后混合菌群對原油的降解效果低于未添加Tween 80的，當Tween 80加量為150 mg/L（5 cmc）時，降解7 d 后混合菌群對原油的降解效果高于未添加Tween 80的，降解率達到了87.12%，能很好地應用于石油污染的修復。

圖6 Tween80在培養基中的cmc值測定

圖7 Tween80加量對菌群降解效果影響

3 結論

從陜北定邊、靖邊油田原油污染土壤中篩選的原油降解菌中不動桿菌D-5、無色桿菌C-2、銅綠假單胞菌A-3對原油的降解率分別為61.46%、39.36%和62.42%，其中，D-5、A-3 可降解原油中大分子烴類，降解作用明顯，C-2 的生物活性高，與菌株A-3、D-5 有較好的相容性，在表面活性劑作用下降解效果顯著。將這3 種菌株進行復配，復配后的混合菌在LB 培養基中45 h 時OD600值達到1.94，在原油培養基中菌數達到4.3×1015個/mL，比單菌數量有所提升。在溫度為35℃、pH 為7.5、搖床轉速為180 r/min、復配菌劑加量比D-5∶C-2∶A-3 為5∶1∶5、加量為6%、表面活性劑Tween80 濃度為150 mg/L 時，混合菌的降解效果可達到87.12%，能很好地應用于石油污染的修復。