玉郎傘查爾酮激活Nrf2/ARE信號通路減輕缺氧/復(fù)氧所致的H9c2細胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷

覃斐章，董 敏，秦秋華，禤霏霏，黃媛恒

1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021；2南寧市第二人民醫(yī)院，南寧 530031

缺血心臟在恢復(fù)血流灌注后損傷進一步加重的現(xiàn)象，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，常見于心臟移植、急性冠脈綜合征和冠脈搭橋術(shù)后。MIRI時產(chǎn)生的大量自由基尤其是活性氧(ROS)不僅能直接損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，還能與NO、脂肪酸、Fe2+反應(yīng)生成毒性物質(zhì)，如ONOO-、OH-等間接損傷細胞。氧化應(yīng)激水平的升高，還能激活凋亡相關(guān)蛋白，使凋亡細胞增多，與心血管重構(gòu)及心力衰竭早期心肌梗死的發(fā)生密切相關(guān)[1]。

Nrf2/ARE(Nuclear factor erythroid derived 2 related factor 2/Antioxidant response element)信號通路是體內(nèi)重要的抗氧化通路，在MIRI的治療中發(fā)揮著重要的作用。Nrf2已被證實廣泛分布于心臟和血管系統(tǒng)[2]。有研究表明，活化的Nrf2可以促進抗氧化酶的表達，清除過量的ROS，降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[3]。用Nrf2 siRNA沉默其表達后，對缺氧/復(fù)氧的心肌細胞的保護作用明顯減弱甚至消失，說明Nrf2的活化對心肌細胞的保護具有十分重要的作用[4]。增強Nrf2活性，還能有效的減輕糖尿病小鼠的心肌損害，延緩缺氧誘導(dǎo)的心肌纖維化的發(fā)展[5]。

1 材料與方法

1.1 細胞

H9c2 心肌細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 試劑與儀器

試劑：YLSC(由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供，HPLC顯示其純度為98%)；ML385購自美國AbMole公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；MTT和胰酶購自美國Amresco公司；ROS 檢測試劑盒及Annexin V-FITC/PI 雙染色流式細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒購自上海碧云天公司；Western blot 一抗Cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2、Nuclear-Nrf2、HO-1、β-actin、lamin B購自美國Santa Cruz 公司；Western blot二抗購自北京中杉金橋公司；考馬斯亮藍蛋白質(zhì)定量試劑盒、LDH、GSH-Px、MDA、SOD測試盒購自南京建成生物工程研究所。

儀器：722S型可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；FACSCanto II流式細胞儀，美國BD 公司；伯樂電泳儀，美國Bio-Rad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組

模型的建立參考文獻[10]。將細胞分正常組、模型組、YLSC低劑量組、YLSC中劑量組、YLSC高劑量組、YLSC高劑量+ML385組。正常組H9c2細胞用含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不經(jīng)任何處理。模型組H9c2細胞使用無血清的DMEM培養(yǎng)液，并置于缺氧盒(94% N2+5% CO2+1% O2)中培養(yǎng)12 h，隨后更換正常培養(yǎng)液并置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱(95%空氣+5%)中培養(yǎng)24 h，復(fù)制心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型。YLSC低、中、高劑量組細胞分別給予終濃度為75、150、300 μg/mL的YLSC孵育24 h，然后進行缺氧/復(fù)氧處理。YLSC高劑量+ML385組細胞先給予3 μg/L ML385培育30 min，再加入300 μg/mL YLSC孵育24 h，然后進行缺氧/復(fù)氧處理。

1.3.2 細胞存活率測定

將細胞以6 ×104個/mL密度接種于96孔板。MTT法測定細胞存活率。每孔加入濃度為5 mg/mL 的MTT 20 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中培育4 h。棄上清液后，每孔加入100 μL DMSO溶解甲結(jié)晶。用酶標儀在570 nm處測定吸光度(A)值。按以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×

100 %

1.3.3 細胞上清液LDH檢測

實驗結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，3 000 rpm 離心10 min，取上清液備用。按試劑盒說明書測定細胞上清液LDH含量。

1.3.4 細胞勻漿SOD、MDA、GSH-Px檢測

加入適量胰酶消化細胞，1 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL PBS，1 000 rpm離心10 min，重復(fù)2～3次。在細胞沉淀中加入0.5 mL PBS溶液，重懸并混勻，在超聲條件下破裂細胞，每次1～2秒，重復(fù)10次，取破碎好的勻漿液進行測定。按試劑盒說明書測定細胞勻漿SOD、MDA、GSH-Px活性。

1.3.5 心肌細胞凋亡率檢測

經(jīng)藥物或缺氧/復(fù)氧預(yù)處理后，胰酶消化細胞，PBS清洗兩次，2 000 rpm離心5 min，收集1×105個心肌細胞。加入100 μL Binding Buffer 重懸細胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。1 h 內(nèi)利用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率。

1.3.6 心肌細胞 ROS檢測

按照試劑盒說明書測定細胞內(nèi)ROS水平。消化并收集1×105個細胞，置于含血清培養(yǎng)基的離心管中，1 500 rpm 離心5 min。用預(yù)冷的 PBS 清洗兩次。加入0.1 μM 的 Dihydroethidium染料500 μL，吹打均勻，37 ℃避光孵育 30 min，過濾收集，利用流式細胞儀檢測細胞 ROS含量。實驗結(jié)果以平均熒光強度表示。

1.3.7 Nuclear-Nrf2、HO-1、Cleaved caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達測定

抽提細胞蛋白，并用BCA法進行蛋白定量。取30 μg蛋白上樣量，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒定電壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。隨后加入相應(yīng)一抗(Nuclear-Nrf2 1∶1 000；HO-1 1∶500；β-actin 1∶200；Lamin B 1∶400；Cleaved caspase 3 1∶500；Bax 1∶400；Bcl-2 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入二抗37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光，X線片顯影、定影，Image J software分析其條帶灰度值。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05時被認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 YLSC對細胞存活率和上清液LDH含量的影響

與正常組比較，模型組心肌細胞存活率明顯下降，細胞上清液中LDH含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量YLSC預(yù)處理后，心肌細胞存活率明顯提高，上清液LDH水平明顯降低，并呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05或P<0.01)。與YLSC-H組比較，YLSC-H+ML385組細胞存活率明顯下降，上清液LDH水平明顯升高(P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 YLSC對細胞存活率和上清液LDH水平的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與YLSC-H組比較，&P<0.05，&&P<0.01，下同。

Note:Compared with normal group,##P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with YLSC-H group,&P<0.05,&&P<0.01,the same below.

2.2 YLSC對細胞ROS和胞漿SOD、MDA及GSH-Px含量的影響

與正常組相比，模型組細胞ROS及MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，YLSC能明顯降低ROS及MDA含量，升高SOD、GSH-Px水平，呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05或P<0.01)。與YLSC-H組比較，YLSC-H+ML385組細胞ROS和MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 YLSC對細胞ROS和胞漿SOD、MDA、GSH-Px含量的影響

續(xù)表2(Continued Tab.2)

組別Group活性氧ROS平均熒光強度丙二醛MDA(nmol/mgprot)超氧化物歧化酶SOD(U/μgprot)谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px(U/μgprot)YLSC中劑量YLSC-M88.53±6.67??9.86±0.80?0.141±0.011??0.710±0.050??YLSC高劑量YLSC-H72.46±5.18??9.35±0.73?0.146±0.028??0.715±0.081??YLSC高劑量+ML385YLSC-H+ML38593.25±10.72&&10.50±1.19&0.126±0.014&0.611±0.058&

圖1 YLSC對H9c2細胞凋亡率的影響

2.3 YLSC對細胞凋亡率的影響

與正常組比較，模型組能明顯增加細胞凋亡率(P<0.01)。與模型組比較，75、150、300 μg/mL的YLSC預(yù)處理可使細胞凋亡率逐漸下降(P<0.05或P<0.01)。與YLSC-H組比較，YLSC-H+ML385組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

2.4 YLSC對心肌細胞缺氧/復(fù)氧Cleaved caspase 3、Bcl-2及Bax 蛋白表達量的影響

與正常組比較，模型組細胞Bcl-2表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Cleaved caspase 3和Bax表達明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，YLSC組Bcl-2表達水平升高，而Cleaved caspase 3和Bax表達水平降低(P<0.05或P<0.01)，呈劑量依賴關(guān)系。與YLSC-H組比較，YLSC-H+ML385組細胞Bcl-2表達明顯下調(diào)，Cleaved caspase 3和Bax表達明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見圖2。

圖2 YLSC對H9c2細胞Cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

2.5 YLSC對心肌細胞缺氧/復(fù)氧Nuclear-Nrf2HO-1蛋白表達的影響

與正常組比較，缺氧/復(fù)氧增加了細胞Nrf2核轉(zhuǎn)移和HO-1的表達(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，YLSC處理后使得Nrf2核轉(zhuǎn)移和HO-1的表達進一步增加，并呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01)。與YLSC-H組比較，YLSC-H+ML385組Nrf2和HO-1的蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，結(jié)果見圖3。

圖3 YLSC對H9c2細胞Nuclear-Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

3 討論

缺血再灌注使細胞活性降低，數(shù)量減少，凋亡細胞增多，最終導(dǎo)致心功能障礙。線粒體在調(diào)控細胞凋亡上起著重要的作用。線粒體功能下降是細胞凋亡的早期表現(xiàn)，伴隨著線粒體膜電位的下降[11]。Bcl-2能維持線粒體的完整性，而Bax則能增加線粒體轉(zhuǎn)換孔的通透性，使AIF和Cyt c從線粒體釋放增加。Caspase 3是Caspase家族的下游蛋白，可導(dǎo)致細胞內(nèi)DNA斷裂，最終引起細胞凋亡。本實驗用流式細胞儀檢測H9c2細胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn) YLSC能減少缺氧心肌細胞的凋亡率，使Bcl-2的表達升高，而Bax和Cleaved caspase 3的表達明顯降低。提示YLSC具有減輕心肌細胞凋亡的作用。

大量研究表明，Nrf2是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。它可使抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶(如NQO1、谷胱甘肽、GSH-Px、SOD等)表達上調(diào)，以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。Nrf2信號通路亦可調(diào)節(jié)線粒體的生物合成和NADPH氧化酶影響細胞內(nèi)ROS的生成[13]。正常情況下，Nrf2與Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)相連，并被Keap1阻止活性。當細胞受到氧化應(yīng)激源作用或其它刺激時，Keap1半胱氨酸殘基被修飾，構(gòu)象發(fā)生改變，Nrf2-Keap1復(fù)合物解離，Nrf2快速由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核。入核的Nrf2與ARE結(jié)合，促進下游的目標基因如γ-glutamylcysteine synthetase、hemeoxygenase 1(HO-1)等的表達[14]。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因敲除小鼠心肌梗死面積增加，心臟保護作用減弱。Triptolide減少缺血再灌注引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，機制與上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白表達有關(guān)[16]。Nrf2還參與了凋亡的調(diào)節(jié)。Das[17]等報道，Nrf2/ARE信號通路通過影響p53、Bax、Bcl-2、Bad、Caspase 3等線粒體依賴的凋亡蛋白影響細胞的生存。介導(dǎo)Nrf2活性的蛋白Keap1，可以與Bcl-2相互作用，調(diào)控細胞的凋亡[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧能使心肌細胞HO-1表達增加，Nrf2在細胞核表達增多。YLSC預(yù)處理24 h后，HO-1和細胞核內(nèi)Nrf2表達進一步增加，同時細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達減少，抗氧化酶表達增加。同時給予Nrf2抑制劑ML385后，可見細胞的凋亡率增加，抗氧化水平降低，Nrf2和HO-1的上調(diào)受到抑制，提示YLSC的抗氧化應(yīng)激和細胞凋亡的作用可能與Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/GSK3β信號通路作為Nrf2的上游通路也參與了Nrf2的調(diào)控[19]。GSK3β能直接磷酸化Nrf2，通過Fyn激酶促進Nrf2核轉(zhuǎn)錄，并使Nrf2在細胞核中失活[20]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，YLSC能激活PI3K/Akt信號通路，減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細胞自噬和凋亡[21]。PI3K/Akt信號通路是否參與了YLSC介導(dǎo)的Nrf2調(diào)節(jié)，在抗氧化反應(yīng)和阻止缺血誘導(dǎo)的細胞凋亡方面發(fā)揮作用，有待于進一步研究。

綜上所述，YLSC預(yù)處理對H9c2細胞缺氧/復(fù)氧損傷有保護作用，能夠顯著降低LDH水平和細胞凋亡率，增加SOD、GSH-Px含量，降低MDA、ROS 水平。增加Nuclear-Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表達，減少Bax和Cleaved caspase 3蛋白表達，其機制可能與激活Nrf2/ARE 信號通路有關(guān)。