不同干燥方法對珠蘭花揮發(fā)油成分及其生物活性的影響

趙昌恒，吳永祥，萬志兵*，武夢雪，王雅莉，曹田中，蘇 興

1黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，黃山 245041；2黃山霧云間生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，黃山 245200

珠蘭Chloranthusspicatus(Tunb.)Makino屬金粟蘭科常綠蔓性亞灌木植物[1]。珠蘭花具有優(yōu)雅香氣，珠蘭花是窨制珠蘭花茶的重要原材料，珠蘭花與茉莉花、白蘭花和玳玳花一起被稱為“中國四大著名茶花”[2]。珠蘭鮮花和茶葉窖制的珠蘭花茶是我國傳統(tǒng)的花茶之一，黃山市歙縣珠蘭花茶歷史悠久，是黃山茶葉的重要組成部分。在故宮博物院收藏的清代《內(nèi)務(wù)府奏銷檔》中，歙縣珠蘭花茶被乾隆皇帝列為貢茶。因而關(guān)于珠蘭花的研究也一直在持續(xù)進(jìn)行中，但是前人研究一直關(guān)注于珠蘭花的栽培繁育等方面。關(guān)于珠蘭花的研究也有一些集中香氣成分研究中[3]，珠蘭花的干燥后的成分分析，以及成分的抗氧化、抑菌性能、對酪氨酸酶抑制作用等方面的研究都未見報道。

植物材料的干燥是植物樣品加工利用的最初步驟，是進(jìn)一步進(jìn)行樣品保存和其功能成分提取的預(yù)處理階段，不同干燥方法的選擇能顯著影響樣品功能性成分的保存。樣品在干燥過程過程中可能會發(fā)生不同程度的熱敏性成分的降解和揮發(fā)散失，也可能導(dǎo)致全新化合物的形成[4]，植物材料不同干燥會導(dǎo)致植物材料抗氧化、抗菌、對酪氨酸酶抑制作用以及感官特征呈明顯差異。Ozdemir等[5]研究表明不同干燥方式影響牛至OriganumvulgareL.揮發(fā)油成分的抗氧化活性；Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同干燥方式檸檬Citruslimon(L.)Burm.f.皮揮發(fā)油的抗菌活性有較大差異。Farag等[7]揭示了大蒜AlliumsativumL.揮發(fā)油在冷凍干燥干燥條件下生物活性優(yōu)于陰干。Liu等[8]研究表明不同干燥方法對杭白芷中的揮發(fā)油成分有一定的影響。因此，在植物資源加工利用過程中干燥方式的選擇至關(guān)重要，探索合適的干燥方式方法具有極為重要的應(yīng)用價值和生產(chǎn)實踐意義。

本研究以珠蘭花鮮花為材料，采用自然干燥和鼓風(fēng)加熱干燥，采用水蒸氣蒸餾法提取干燥后珠蘭花的揮發(fā)油，使用GC-MS對揮發(fā)油成分進(jìn)行化學(xué)成分的定性和定量分析，探究干燥后的珠蘭花揮發(fā)油的還原能力、對DPPH和ABTS自由基的清楚能力及抑菌效果、對酪氨酸酶抑制作用，為珠蘭花的綜合利用于進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

珠蘭花鮮花2019年5月采自于黃山霧云間生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司生產(chǎn)基地。新鮮珠蘭花除去枝梗后分別采用陰干和熱風(fēng)干燥2種方法干燥至恒重，熱風(fēng)干燥，具體方法是：38 ℃，2 h；40 ℃，12 h；50 ℃，3 h，干燥后粉碎過20～40目篩子，干燥的珠蘭花粉末保存于干燥器中存放。大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa等購于無錫賽維科技有限公司。DPPH、ABTS、酪氨酸酶(tyrosinase，50 000 units)、左旋多巴等購于Sigma公司。白胨、牛肉膏、瓊脂：生物試劑，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。SQ510C型高壓滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)；AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；SpectraMax-190型全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

稱取經(jīng)過干燥后的珠蘭花粉末100.0 g 置于燒杯中，加重蒸餾水350 mL，用揮發(fā)油提取器按水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集無水乙醚層，揮發(fā)無水乙醚溶劑，加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，得到具有濃郁香味淡黃色透明油狀物。取適量揮發(fā)油用正己烷稀釋，用于GC-MS檢測，其余的揮發(fā)油密封保存于4 ℃條件下，用于抗氧化、抑菌活性以及酪氨酸酶抑制作用的實驗。

1.2.2 揮發(fā)油成分分析

色譜條件：選用HP-5 MS 彈性石英毛細(xì)光柱(0.25 μm，30 m×0.25 mm)；載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL/min；分流比為40∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL；進(jìn)樣口溫度為60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV，四級桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍為35～450 u；溶劑延遲時間3 min；采用NIST08標(biāo)準(zhǔn)普庫進(jìn)行檢索。

1.2.3 揮發(fā)油的抗氧化活性測定

1.2.3.1 清除DPPH自由基活性的測定

參考文獻(xiàn)Cherrat等[9]的方法略作改進(jìn)：取1 mL不同濃度梯度珠蘭花揮發(fā)油(0.0、0.9、1.8、3.6 mg/mL)，加入3 mL DPPH-乙醇溶液，黑暗且室溫條件下震蕩30 min，測定波長為517 nm處樣品的吸光度，并計算自由基清除率I：I=(AO-AS)/AO×100%，計算公式中：AO為空白樣品吸光度；AS為珠蘭花揮發(fā)油和抗壞血酸樣品溶液吸光度。

1.2.3.2 清除ABTS自由基活性的測定

參照Hu等[10]的方法并略作修改，分別配置濃度為7 mmol/L的ABTS水溶液和濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液，兩者按照等比例混合，混合液置于黑暗條件下反應(yīng)16 h。以無水乙醇稀釋調(diào)整至在波長734 nm處吸光度為0.70±0.000 5，制備得到ABTS+溶液。取0.3 mL不同濃度梯度揮發(fā)油-乙醇樣液，加入2.7 mL ABTS+溶液，30 ℃水浴加熱6 min，于波長734 nm處測定吸光度，并計算自由基清除率I。

1.2.4 揮發(fā)油的抑菌活性測定

參考Abdelli等[11]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。將活化后的大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis和綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa，以平板菌落計數(shù)法調(diào)整至106～107CFU/mL。MH(Mueller Hinton)平板中加入調(diào)整后的4種菌懸浮液100 μL，用涂布棒均勻涂布，并干燥。在中央加入10 μL揮發(fā)油，以丙酮為空白對照，以5%吐溫80溶液為陰性對照，以對羥基甲酸丙酯(propylparaben，PP)為陽性對照，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，設(shè)置3次重復(fù)，測量記錄抑菌圈(diameters of inhibition zones，DIZ)直徑的大小，以mm為單位，取其平均值。

1.2.5 揮發(fā)油酪氨酸酶抑制作用的測定

根據(jù)Tang等[12]的測定方法稍加改進(jìn)，具體如下：向96孔板中依次加入50 μL磷酸緩沖液(pH=6.8)、80 μL 10 mM的左旋多巴與50 μL不同濃度(0.9、1.8、3.6 mg/mL)的 HAD-VO和SD-VO，混勻后反應(yīng)5 min，加入20 μL 125 unit/mL的酪氨酸酶溶液，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，于475 nm波長處測定吸光度值。以Arbutin為陽性對照，并按照下列公式計算酪氨酸酶抑制率：

式中，I：表示酪氨酸酶抑制率；AS：表示樣品組吸光度值；ASB：表示樣品對照組吸光值；AC：表示空白組吸光值；ACB：表示空白對照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行輸入和初步處理，使用SPSS18.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方法對珠蘭花揮發(fā)油成分及含量的影響

不同干燥方法珠蘭花揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS分析的總離子流圖見圖1。由圖1可知，兩種方法干燥后珠蘭花揮發(fā)油總離子流圖基本相似。用NIST08質(zhì)譜圖庫對各組分峰進(jìn)行檢索，兩種干燥處理所得的揮發(fā)油共鑒定出62種化合物，鼓風(fēng)加熱干燥法(HAD-VO)鑒定出58種，被鑒定化合物相對含量占揮發(fā)油總量的94.12%，陰干法(SD-VO)鑒定出56種，被鑒定化合物相對含量占揮發(fā)油總量的92.43%，兩種方法共有物質(zhì)52種。珠蘭花揮發(fā)油化合物種類較多，以烯、酮、醇為主。鼓風(fēng)加熱干燥法中烯類物質(zhì)占47.95%，陰干法中稀類物質(zhì)占38.84%。酮類物質(zhì)分別為11.82%和15.5%，醇類物質(zhì)分別為24.29%和31.22%。珠蘭花揮發(fā)油中含量較高成分有1-(1，4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮(HAD-VO:11.33%，SD-VO:15.55%)，別香橙烯(HAD-VO:6.12%，SD-VO:11.25%)，匙桉醇(HAD-VO:5.75%，SD-VO:5.94%)，3-甲氧基苯甲醇(HAD-VO:5.08%，SD-VO:11.04%)。

圖1 珠蘭花熱風(fēng)干燥(a)、陰干(b)揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

表1 不同干燥處理珠蘭花揮發(fā)油的化學(xué)成分及其相對含量

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對含量Relativecontent(%)HAD-VOSD-VO3831.40肉豆蔻醚MyristicinC11H12O32.071.683931.50表水菖蒲酮EpishyobunoneC15H24O0.49-4031.97異丁香酚甲醚MethylisoeugenolC11H14O20.16-4132.32橙花叔醇NerolidolC15H26O0.840.604232.61γ-芹子烯γ-SelineneC15H240.380.214333.16雅欖藍(lán)烯Eremophilene C15H24-0.174433.31匙桉醇EspatulenolC15H24O5.755.944533.584-丁基茴香醚4-ButylanisoleC11H16O0.29-4633.692,5-二叔丁基-1,4-苯醌2,5-Di-tert-butyl-1,4-benzoquinoneC14H20O21.701.504733.901-(1,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮1-(1,4-Dimethyl-3-cyclohexen-1-yl)-EthanoneC10H16O11.3315.554834.02去羥基異水菖蒲二醇Dehydroxy-isocalamendiolC15H24O0.480.294934.12苯并[b]噻吩-3-乙酸Benzo[b]thiophene-3-aceticacidC10H8O2S1.080.515034.26τ-杜松醇τ-CadinolC15H26O3.445.275134.47SpirojatamolC15H26O1.010.975234.61(-)-桉油烯醇(-)-SpathulenolC15H24O0.530.545334.66異斯巴醇Isospathulenol C15H24O0.650.605434.92α-杜松醇α-CadinolC15H26O3.873.335535.05β-桉葉醇β-EudesmolC15H26O0.380.465635.18NeointermedeolC15H26O0.540.645735.24α-紅沒藥醇α-BisabololC15H26O0.640.455835.37β-桉葉烯β-EudesmeneC15H240.160.195935.53α-愈創(chuàng)木烯α-GuaieneC15H240.280.246036.09異喇叭烯IsoledeneC15H240.430.506136.20茉莉酮酸甲酯MethyljasmonateC13H20O30.390.416237.503-甲氧基苯甲醇3-MethoxybenzylalcoholC8H10O25.0811.04

2.2 揮發(fā)油的抗氧化活性測定

珠蘭花揮發(fā)油和陽性對照清除ABTS自由基能力如表2所示。珠蘭花揮發(fā)油有一定的ABTS自由基清除能力，在0.9～3.6mg/mL內(nèi)，熱風(fēng)干燥珠蘭花揮發(fā)油對ABTS自由基清除率分別為10.08%、23.20%、50.91%，而陰干珠蘭花揮發(fā)油對ABTS自由基清除率分別為6.13%、11.98%、21.90%。不同種干燥方式的珠蘭花揮發(fā)油對ABTS自由基清除率隨著揮發(fā)油質(zhì)量濃度的增加，清除能力隨之增強。在珠蘭花揮發(fā)油相同濃度下，熱風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油對ABTS自由基清除率顯著高于陰干的珠蘭花。最高濃度的熱風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油對ABTS自由基清除率也顯著低于陽性對照。

由表2可知，珠蘭花揮發(fā)油對DPPH自由基清除能力表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，隨著珠蘭花揮發(fā)油濃度的增加，DPPH自由基清除能力也隨之增強，前差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在揮發(fā)油相同濃度下，熱風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油對DPPH自由基清除率顯著高于陰干的珠蘭花。在珠蘭花揮發(fā)油濃度為3.6mg/mL時，熱風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油對DPPH自由基清除率為61.36%，顯著高于陰干的珠蘭花揮發(fā)油對DPPH自由基清除率32.57%，但是顯著低于陽性對照對DPPH自由基清除率81.42%。

表2 不同干燥處理對珠蘭花揮發(fā)油抗氧化活性的影響

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column show statistically significant differences(P<0.05).

通過以上分析表明，珠蘭花揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性，但活性相對較弱。可能需要提高揮發(fā)油濃度才能達(dá)到陽性對照對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率。

2.3 揮發(fā)油的抗菌活性測定

由圖2可知，珠蘭花揮發(fā)油對四種供試菌均有一定的抑制作用，但其抑菌活性要弱于對羥基苯甲酸丙酯。珠蘭花揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果，鼓風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油最大的抑菌圈直徑為13.50±0.61 mm，陰干的珠蘭花揮發(fā)油最大的抑菌圈直徑為12.83±1.18 mm，都低于陽性對照PP(1 mg/mL)濃度為1.0 mg/mL時，最大抑菌圈直徑14.53±1.00 mm，但是差異沒有達(dá)到顯著水平。

珠蘭花揮發(fā)油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌具有一定的抑菌作用，鼓風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油最大的抑菌圈直徑分別為10.97±0.47、11.23±0.12、12.10±0.82 mm，陰干的珠蘭花揮發(fā)油最大的抑菌圈直徑分別為9.83±0.35、9.53±0.25、12.27±1.33 mm，但都顯著低于陽性對照。鼓風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油對大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制顯著強于陰干的珠蘭花揮發(fā)油對兩者的抑制。也表明這兩種干燥方法對于珠蘭花成分的保存存在一定的差異。

圖2 不同干燥處理對珠蘭花揮發(fā)油抑菌作用的影響

2.4 揮發(fā)油酪氨酸酶抑制作用的測定

不同干燥處理對珠蘭花揮發(fā)油酪氨酸酶抑制作用見圖3。從圖3可以看出，鼓風(fēng)干燥或者陰干處理中，同一種干燥方式中隨著濃度的增加抑制酪氨酸酶的活性增強，表現(xiàn)為呈濃度依賴的方式抑制酪氨酸酶活性。在揮發(fā)油濃度為3.6 mg/mL時，鼓風(fēng)干燥的珠蘭花揮發(fā)油對酪氨酸酶抑制作用達(dá)到68.47%，略高于對照組的64.61%，但是沒有達(dá)到顯著水平，顯著高于陰干的珠蘭花揮發(fā)油對酪氨酸酶抑制作用(51.63%)。

圖3 不同干燥處理對珠蘭花揮發(fā)油酪氨酸酶抑制作用的影響

3 討論與結(jié)論

野生植物資源是人類擁有的無比巨大的財富，開發(fā)利用野生植物資源有利于保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)中各個物種的平衡，也是實施天然林資源保護(hù)的需要，并符合經(jīng)濟(jì)開發(fā)中的物盡其用、綜合開發(fā)、產(chǎn)生最大經(jīng)濟(jì)效益的原則，因此，合理開發(fā)利用我國豐富的野生植物資源對其經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著巨大作用。野生植物資源含有的各種對人類生產(chǎn)、生活有用的化合物，對植物資源的成分的研究，有助于進(jìn)一步開發(fā)利用植物資源。

許多植物中蘊藏著迄今人們?nèi)晕吹弥脑S多有用成分。本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取珠蘭花的揮發(fā)油，通過GC-MS對揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定出62種化合物，鼓風(fēng)加熱干燥法鑒定出58種，被鑒定化合物相對含量占揮發(fā)油總量的94.12%，陰干法鑒定出56種，被鑒定化合物相對含量占揮發(fā)油總量的92.43%，兩種方法共有物質(zhì)52種，表明這兩種干燥方法導(dǎo)致成分及含量存在一定的差異，這與Liu等[8]研究不同干燥方法對杭白芷中揮發(fā)油類化學(xué)成分的影響結(jié)果類似，以及Cheng等[13]研究不同干燥方法對紅花玉蘭揮發(fā)油成分的結(jié)果都相似，也說明干燥方式的研究對于開發(fā)利用植物資源具有重要意義。

珠蘭花揮發(fā)油化合物種類較多，以烯、酮、醇為主。Wang[3](2003)采用同時-蒸餾萃取法制備珠蘭花香精油，利用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用分析從珠蘭中鑒定出78種香氣化合物，其中醇類15種，酯類4種、碳?xì)浠衔?4種，酮類6種，醛類2種，含氮化合物2種，其它5種。可見珠蘭花中化學(xué)成分種類非常豐富。珠蘭花揮發(fā)油中含有多種具有應(yīng)用價值的化學(xué)成分，如1-(1，4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮是珠蘭花揮發(fā)油成分中含量最高的物質(zhì)，鼓風(fēng)加熱干燥方式中含量為11.33%，陰干方式中含量為15.5%，而該物質(zhì)也是毛細(xì)辛和銅錢細(xì)辛揮發(fā)油中含量最高的物質(zhì)，含量分別為14.16%和14.24%[14]。這種物質(zhì)的功能尚未明確，但是細(xì)辛具有歸心、肺、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、溫肺化飲的功效，臨床上常用于治療風(fēng)寒頭疼、痰飲咳喘、關(guān)節(jié)疼痛、鼻塞、牙痛等[15]，細(xì)辛也是治療新型冠狀病毒肺炎通用方劑中的成分之一[16]。該物質(zhì)在珠蘭花中含量也是最高的，表明珠蘭花有繼續(xù)開發(fā)利用的可能性。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用珠蘭花資源提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)對珠蘭花的綜合開發(fā)利用。

珠蘭花揮發(fā)油具有顯著的DPPH和ABTS自由基清除能力，鼓風(fēng)加熱干燥珠蘭花揮發(fā)油較陰干珠蘭花揮發(fā)油具有更強的DPPH和ABTS自由基清除能力，抗氧化能力與揮發(fā)油質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，濃度越高珠蘭花揮發(fā)油抗氧化能力越強。珠蘭花揮發(fā)油抗氧化活性與其化學(xué)組成及含量有關(guān)系，烯烴、酮是重要的抗氧化活性成分[17,18]。珠蘭花揮發(fā)油成分種類多，各種成分之間也存在一定的協(xié)同作用，也在一定程度上加強抗氧化活性[19]。從抑菌結(jié)果可知，珠蘭花揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌具有一定的抑菌作用。鼓風(fēng)加熱烘干珠蘭花揮發(fā)油抑制強度依次為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢菌>綠膿桿菌>大腸桿菌。陰干珠蘭花揮發(fā)油抑制強度依次為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢菌>大腸桿菌>綠膿桿菌。

珠蘭花揮發(fā)油對酪氨酸酶活性均具有一定的抑制能力，在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增大，抑制率逐漸升高。在相同濃度揮發(fā)油的條件下，鼓風(fēng)加熱干燥珠蘭花揮發(fā)油顯著強于陰干珠蘭花揮發(fā)油。酪氨酸酶是黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶[20]，它可催化L-酪氨酸生成多巴，多巴逐步氧化生成多巴醌，進(jìn)而形成色素顆粒，是引發(fā)黃褐斑、雀斑、老年斑及黑色素瘤等疾病的主要原因。酪氨酸酶抑制劑是現(xiàn)代美白化妝品和皮膚用藥的主要組成成分。植物資源中含有的天然活性成分毒副作用小、安全性高，比化學(xué)合成的抑制劑具有更大優(yōu)勢，因此近年來逐漸成為酪氨酸酶抑制劑研究者的關(guān)注熱點。也表明珠蘭花可進(jìn)一步開發(fā)成美白化妝品，甚至可以填加在皮膚用藥中。

綜上，鼓風(fēng)干燥是珠蘭花最佳的干燥方法，珠蘭花揮發(fā)油成分中有抗氧化、抑菌、酪氨酸酶抑制作用，珠蘭花揮發(fā)油可進(jìn)一步開發(fā)利用成美白化妝品或皮膚用藥中，本研究對珠蘭花揮發(fā)油提取工藝和產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。