龍膽苦苷對大鼠肝纖維化Sonic Hedgehog信號通路的影響

李梓萌，周 僮，高 雅，徐 杰，連苑宇，冼紅良，李迎迎，張可鋒

桂林醫學院，桂林 541004

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各類以肝細胞為靶點的慢性肝病所引起的，其中包括慢性病毒性肝炎、脂肪性肝炎和自身免疫性肝炎等[1]。HF與炎癥反應和修復反應所致肝實質細胞和非實質細胞的變化有關，其中存在于肝竇周隙內的肝星狀細胞(HSC)的活化是HF的關鍵因素，主要表現為α-平滑肌激動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達增加，及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的大量分泌，特別是膠原蛋白的過度沉積，同時分化為成纖維細胞，引起纖維結締組織的厚化與增生[2]。

龍膽苦苷(gentiopicroside，GPS)屬于裂環烯醚萜苷類化合物，具有解熱抗炎、鎮痛、保肝、利膽、增強免疫和抗高血壓等功效[3]。有研究表明GPS能減緩或逆轉肝損傷、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎及肝內膽汁淤積等疾病，其機理主要與降低炎癥反應、抑制氧化應激、調節血脂和增強機體免疫力有關[4,5]。

在纖維化過程中的一個重要特征是Sonic Hedgehog(Shh)信號通路的異常激活，Shh信號通路在胚胎發育中可調控細胞的增殖、分化，而在正常成熟組織中無表達，具有高度的保守性[6,7]。Shh信號通路可以調節成人肝臟組織中的傷口愈合反應，并且Shh信號通路對肝纖維化的促進作用與HSC的激活呈正相關，表明Shh信號可能是肝纖維化的潛在治療靶標[8]。然而，目前尚無GPS對Shh信號傳導途徑作用的研究，因此本文旨在研究GPS能否通過抑制Shh信號通路從而發揮對肝臟的保護作用。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，共40只，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2016-0002，倫理委編號:GLMC201609026。

1.2 實驗藥物與試劑

龍膽苦苷藥品(南京道斯夫生物科技有限公司，純度>98%，批號：181116A)；分析純CCl4(廣東汕頭市西隴化工廠)；秋水仙素(上海如吉生物科技發展有限公司，純度>99%)；門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(南京建成生物工程公司)；白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、透明質酸(HA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；Ⅳ型膠原蛋白(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)、層粘連蛋白(LN)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術研究所)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)；轉化生長因子-β1(TGF-β1)抗體、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Abcam，英國)；Shh蛋白抗體、Gli1蛋白抗體(賽默飛世爾科技有限公司)；β-actin抗體(天錫傲銳東源生物科技有限公司)；辣根酶標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Super ECL Plus超敏發光液(北京酷來博科技有限公司)。

1.3 儀器

THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；TGL-16K臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)；Olympus BX51顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；Epoch酶標儀(Bio-tek公司，美國)；垂直電泳儀、轉膜儀(Bio-Rad公司，美國)；上海天能全自動化學發光圖像分析檢測系統。

2 方法

2.1 造模及給藥

將40只雄性SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分成4組，即正常組、模型組、秋水仙素(0.12 mg/kg)組及GPS(100 mg/kg)[4]組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均每周腹腔注射兩次40%的CCl4橄欖油溶液(1 mL/kg)，建立HF大鼠模型。除正常組和模型組大鼠灌胃相應體積(10 mL/kg)的生理鹽水外，其余各組大鼠每天在固定時間灌胃相應體積(10 mL/kg)藥物，持續6周。末次給藥后，禁食不禁水，16 h后收集血液和肝組織。

2.2 實驗大鼠情況觀察

對大鼠的外觀體征、行為活動、體重變化和肝臟的外觀、形態進行觀察記錄。

2.3 肝組織病理學檢測

取各組大鼠相同位置肝組織，用4%多聚甲醛水溶液固定，經包埋和切片處理后，分別進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色和Masson染色，并在光學顯微鏡下觀察肝組織的病理改變。

2.4 肝組織免疫組化

肝組織切片置于70 ℃溫箱中恒溫30 min，再于二甲苯中脫蠟。用枸櫞酸鈉抗原修復液加熱進行抗原修復，修復后切片冷卻至室溫。組織切片被依次加入過氧化氫和牛血清白蛋白。分別用一抗α-SMA和TGF-β1孵育1 h，二抗孵育1 h。最后，用DAB浸泡5 min著色，用蘇木精復染，光學顯微鏡下觀察結果并拍攝。

2.5 血清中相關指標測定

將所收集的血液于4 ℃條件下，4 500 rpm離心15 min后分離血清。采用生化法分別測定血清中ALT、AST、TBIL、ALB含量；采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)分別測定血清中HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C含量。上述指標的測定均嚴格按照檢測試劑盒說明書操作，并采用酶標儀測定吸光度，根據標準曲線及公式分析計算ALT、AST、TBIL、ALB、HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C含量。

2.6 蛋白表達情況的測定

采用蛋白免疫印跡法(Western blot)測定肝組織中TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白的表達水平。取各組大鼠肝組織約60 mg，置于玻璃勻漿器中，再加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液1 mL，于冰上充分研磨。待組織完全裂解后，于4 ℃下，12 000 rpm離心10 min后取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟對蛋白含量進行測定。加入蛋白樣品緩沖液，并在95 ℃水浴中變性蛋白質20 min。將蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白。于300 mA冰水浴條件下以恒流轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，使用TBST洗滌3次，10 min/次。放入Ⅰ抗輕搖半小時后，于4 ℃下孵育過夜；次日，使用TBST同上洗滌3次，放入Ⅱ抗于室溫下孵育1.5 h，使用TBST同上洗滌3次，采用ECL法顯色，Tanon5 200全自動化學發光圖像分析系統顯影，以β-actin為內參，分析蛋白灰度并計算蛋白相對表達量。

2.7 數據統計學分析

32 結果與分析

3.1 GPS對HF大鼠狀況的影響

正常組大鼠狀態良好，活動靈敏，皮毛光澤，飲食和排便正常，體重明顯增加。模型組大鼠精神明顯萎靡，活動遲緩，皮毛無光澤度，食欲減退，排便清稀。與模型組比較，秋水仙素組和GPS組狀況均明顯改善，GPS組對HF大鼠狀況改善效果更佳。

3.2 GPS對HF大鼠肝組織形態的影響

經肉眼觀察，正常組大鼠肝組織色澤紅潤，表面光滑，邊緣銳利。模型組肝組織顏色暗沉，無光澤，表面粗糙且伴有明顯的顆粒，邊緣鈍化。與模型組比較，秋水仙素組和GPS組大鼠肝損傷病理特征均有不同程度的改善，且部分肝組織已恢復至正常(見圖1)。

圖1 GPS對HF大鼠肝臟形態的影響

圖2 HE染色觀察GPS對HF大鼠肝組織病理形態的影響(×200)

HE染色結果顯示，正常組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊且生長情況正常，未見纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉正常結構被破壞，大量肝細胞變性且壞死，伴有纖維組織增生和炎性細胞浸潤現象，表明造模成功。與模型組相比較，秋水仙素組及GPS組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞壞死、纖維化及炎癥程度均有所改善，表明GPS可改善大鼠肝纖維化(見圖2)。

Masson染色結果顯示，正常組的肝細胞結構完整，排列整齊，無藍色膠原纖維沉積。模型組大鼠肝組織出現大量藍色膠原纖維沉積，伴有肝細胞水腫，纖維化程度明顯。與模型組相比較，秋水仙素組和GPS組大鼠肝組織病理損傷明顯減輕，纖維化程度均有不同程度的改善(見圖3)。

圖3 Masson染色觀察GPS對HF大鼠肝組織病理形態的影響(×200)

3.3 GPS對HF大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，正常組中TGF-β1和α-SMA無明顯表達。模型組TGF-β1和α-SMA表達增多，主要在受損肝細胞周圍肝血竇和纖維間隔內表達。秋水仙素組和GPS組TGF-β1和α-SMA表達明顯減弱，多在纖維增生處表達(見圖4和5)。

圖4 GPS對HF大鼠肝組織TGF-β1表達的影響(×200)

圖5 GPS對HF大鼠肝組織α-SMA表達的影響(×200)

3.4 GPS對HF大鼠血清ALT、AST、TBIL和ALB的影響

模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平較正常組大鼠均顯著升高，ALB水平顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.01)。GPS組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平較模型組均顯著下降，ALB水平顯著升高，差異均具有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

3.5 GPS對HF大鼠血清HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影響

模型組大鼠血清中LN、HA、PC Ⅲ和Ⅳ-C含量較正常組大鼠均顯著升高，差異均具有統計學意義(P<0.01)，說明本實驗造模成功。GPS組大鼠血清中HA，LN，PC Ⅲ和Ⅳ-C含量較模型組大鼠均顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.01)，此結果表明GPS對CCl4所造成的肝損傷具有保護作用(見表2)。

表1 GPS對血清中ALT、AST、TBIL和ALB的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

Note:Compared with normal group,##P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;The same below.

表2 GPS對血清中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影響

3.6 GPS對HF大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白表達的影響

模型組大鼠肝組織中TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白表達量較正常組大鼠均顯著升高，差異均具有統計學意義(P<0.01)；GPS組較模型組大鼠可明顯抑制TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l表達，差異均具有統計學意義(P<0.01)，此結果表明GPS抗肝纖維化可能與Shh信號通路有關(見圖6)。

圖6 GPS對TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白表達的影響

4 結論

肝纖維化是機體肝臟受損時的自我修復反應，是可逆的病變過程，但當各種因素造成肝損傷不能得到及時緩解時，可最終發展為不可逆的肝硬化，對人體造成巨大危害[9,10]。而目前肝臟疾病在我國具有較高的發病率和致死率，因此，研究GPS對肝臟的保護作用具有重要意義[11]。

本實驗采用CCl4造模，CCl4為經典的HF誘導劑，所建立的大鼠HF模型與人體HF的病理學改變極為相似[12]。CCl4造成肝損傷的機制是破壞肝細胞膜的完整性，使其通透性增加，導致肝細胞內AST、ALT進入血清，可通過測定血清中AST、ALT含量來觀察肝臟受損程度[13,14]。與此同時，肝細胞的排泄功能降低，導致膽紅素的排出發生障礙，使血清中TBIL水平顯著增高，因此通過測定血清中TBIL水平可反映肝臟的分泌、排泄和解毒功能[15]。合成ALB是肝臟的特有功能，CCl4誘導生成HF后肝臟合成功能發生障礙，使血清中ALB水平顯著下降[16]。HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C是肝細胞外基質的主要成分，肝損傷時可導致其合成大于降解，導致過多沉積于肝組織中，誘發HF，因此ECM含量高低可反映HF程度[17]。在本研究中，模型組大鼠血清中AST、ALT、TBIL、HA、LN、PC III及IV-C含量顯著升高，ALB含量顯著下降，且經HE染色和Masson染色后，可明顯觀察到肝組織病理切片中模型組大鼠肝損傷較為嚴重，具有明顯HF的特征，提示CCl4造模成功。GPS給藥后，大鼠血清中AST、ALT、HA、LN、PC III及IV-C含量顯著降低，ALB含量顯著上升，HF染色結果病變程度改善，可推測GPS對CCl4誘導的HF大鼠具有保護作用。

TGF-β1是促進HF的主要因子，可通過上調HSC而合成大量的ECM，加速肝纖維化，TGF-β1的表達與肝纖維化程度成正相關[18]。α-SMA可反映HSC的活化情況，作為HSC激活的標志性蛋白，同時也可用于評估肝纖維化程度[19]。實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA的蛋白表達水平顯著提高；采用GPS給藥后，大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA的蛋白表達水平較模型組顯著降低。此結果表明GPS可通過抑制TGF-β1蛋白表達而發揮抗HF作用。

Shh在多種癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用，Shh異常激活會誘導細胞過度增殖和惡性改變[20]。Shh信號通路主要由Shh配體、兩個跨膜蛋白受體(Smo、Ptch)及下游轉錄因子Gli家族(Gli 1、Gli 2、Gli 3)等組成，Shh配體與Smo受體是該信號通路的激動因子，Ptch受體是該信號通路的抑制因子，其中Gli 1是Shh通路重要的效應基因，且Gli 1的活化是Shh信號通路激活的重要標志[21]。Shh與Ptch結合后導致Ptch對Smo的抑制作用解除，在細胞核中Smo可誘導轉錄因子Gli家族的激活，HSC活化時，胞內有Shh配體表達，可激活Shh信號通路促使HSC增殖[22]。因此，抑制Shh信號的激活將有助于抑制HF。實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織Shh和Gli l的蛋白表達水平顯著提高；采用GPS給藥后，大鼠肝組織Shh和 Gli l的蛋白表達水平較模型組顯著降低。此結果表明GPS可通過抑制Shh信號通路而發揮抗HF作用。綜上表明，GPS對肝纖維化具有保護作用，其機制可能與抑制Shh信號通路有關。