楓香脂干預類風濕關節炎機制的分子對接研究

滿 達，白明慧，木其爾，呼格吉樂，秀布松，黃樹青，特木其樂

1內蒙古自治區國際蒙醫醫院治未病中心；2內蒙古自治區國際蒙醫醫院急診科；3內蒙古自治區國際蒙醫醫院點穴科；4內蒙古自治區國際蒙醫醫院腦病中心，呼和浩特市 010020

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及周圍關節的多系統、炎癥性的自身免疫性疾病，其病理特征為關節滑膜慢性炎癥，侵犯下層軟骨造成關節破壞，全世界每年的發病率大約1%～3%[1]。RA使患者承受長期的疼痛，致殘率高，嚴重影響生活質量。其病因主要有遺傳、感染、內分泌及寒冷、潮濕、疲勞外傷等。西藥治療RA的作用機制明確，但作用效果單一，其副作用多，需要和其他藥物聯合使用效果更佳。蒙醫上RA屬于托列病的范疇，根據文獻記載托列病分為齊素協日型、巴達干赫依型及協日烏素型3個證型。臨床上蒙藥對RA治療作用良好，副作用小，有著很大的研究空間。

楓香脂，又稱“白云香”、“查干古古勒”、“伯依嘎日”，為金縷梅科植物楓香樹(LiquidambarformosanaHance)的干燥樹脂。蒙醫學認為白云香味苦、辛，性涼、燥、輕、銳；有燥膿及黃水，消腫，療傷，止痛，解毒之功效。臨床主要應用于痛風、痹病、黃水病(包含托列病)、關節疼痛、疥癬、禿瘡、白癜風、皮膚瘙癢等皮膚病及咽喉腫痛、乳腺炎等，是蒙醫臨床上應用較廣的藥物之一。現代研究發現，楓香脂有效活性成分有(+)-2-bornanone、ethyl iso-allocholate、α-terpineol等13種，具有抗菌、殺蟲止癢、消腫止痛的功效[2]。楓香脂一直廣泛應用于治療RA的蒙醫方劑中，如楓香脂十五味丸、云香十五味丸、風濕二十五味丸、孟根烏蘇-18等治療RA的方劑中均有楓香脂。由于楓香脂含有多種活性成分多[3]，其治療RA作用靶點及機制尚不完全明確，若按傳統的提取分離到活性測定，時間長、難度大。

網絡藥理學由英國藥理學家Hopkins在2007年提出，是基于系統生物學理論，運用各種組學、高通量篩選、網絡分析等技術揭示“藥物-靶點-疾病”間的復雜網絡關系，打破既往單成分-單靶點-單疾病的研究模式，對預測中藥多成分、多靶點、多途徑的作用機制具有重要意義[4]。網絡藥理學是中藥、蒙藥研究領域最常見的技術之一。例如，Liang等[5]基于網絡藥理學系統揭示了新天泰1號通過多成分-多靶點-多途徑綜合調控阿爾茨海默病的物質基礎和生物學機制，Li等[6]基于網絡藥理學探討了全石榴“助胃火”治療功能性胃腸病的作用機制，Man等[7]通過計算機輔助的數據挖掘以及藥理學方法，預測探討蒙藥治療薩病的作用機制。

在此背景下，本次研究基于網絡藥理學方法與分子對接，對楓香脂有效活性成分治療RA的作用機制進行研究，初步闡明其多成分-多靶點-多通路協同的作用機制，為后期進行生物學驗證提供理論依據和研究方向。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

TCMID數據庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCM-ID數據庫(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/3017)為用于查詢藥物全部成分數據庫；SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測小分子靶點；TTD數據庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、NHGRI(https://www.genome.gov/)、GWAS(Genome-wide association analysis)進行疾病靶標預測；STRING在線數據庫(https://stringdb.org/)中獲取蛋白互作網絡數據；Metascape平臺(http://metascape.org)進行富集分析；Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)進行蛋白名稱、格式矯正。

Gephi軟件(下載地址https://gephi.org/)構建“成份-靶點”互作用網絡圖和蛋白互作用網絡圖；LeDock(http://lephar.com/)為基于網絡藥理學的預測和分析分子對接軟件。

1.2 方法

1.2.1 楓香脂的成分來源

以“楓香脂”為關鍵詞，從TCMID、TCM-ID平臺及相關文獻查詢楓香脂的全部成分，利用SwissADME數據庫，篩選出化合物的“GI absorption”(該數據中口服生物利用度的評價指標)標記為“High”，同時“LiBinski”(該數據庫中類藥性指數的評價指標)標記為“Yes”的活性成分。

1.2.2 活性成分作用靶點及RA作用靶點的獲取

將上一步驟中得到的藥物活性成分以smile格式逐一輸入SwissTargetPrediction數據庫，以物種“homo sapiens”為篩選條件，檢索到相應的靶點，選取“probability”大于零的作用靶點。

從TTD、NHGRI、GWAS等數據庫查找RA相關靶點，將各活性成分靶點與RA相關靶點進行比對，篩選出的共同靶點即為楓香脂治療RA的靶點。

1.2.3 “成分-靶標”網絡構建

將“1.2.1”項篩選出的楓香脂活性成分和“1.2.2”項得到的治療RA的靶點導入Gephi 軟件中，構建楓香脂的“成分-靶點”網絡。

1.2.4 靶點相互作用網絡構建

通過數據庫String獲取楓香脂活性分子與RA相關靶標的相互關系，并將數據導入軟件Gephi中構建靶標間相互作用網絡，將節點設置為不同大小和顏色，用于反映degree值(連接度，即在網絡中通過該點的邊的個數)的大小。

1.2.5 信號通路富集分析

通過上述步驟取得關鍵靶點后，應用Metascape平臺(http://metascape.org)進行信號通路富集分析，可視化展現主要信號通路，進一步分析楓香脂治療RA的可能作用機制。Metascape平臺是一個基因注釋分析數據庫，不僅能提供全面的功能注釋，而且擁有數據庫更新及時、使用免費、操作簡便等特點。Metascape有去除冗余的功能，把功能相近的通路合成一個簇，顯示更直觀、清晰。將楓香脂治療RA的預測疾病共有靶點導入Metascape，設置物種為人，進行生物過程、通路分析，根據靶點數目的多少對結果進行排序，保留排名靠前的結果。

1.2.6 活性成分與相關靶點的分子對接

分子對接通過預測出受體和配體的結合構象和親和力來進行小分子改造和設計，由此獲得藥物開發的依據。2016年，Hou等[8]對常用的10種分子對接軟件進行對比后，發現LeDock對2 002個蛋白配體復合物的對接進行評估時有明顯的優勢。LeDocK是由趙洪濤研發的分子對接軟件，它在ASTEX多樣性集上實現了超過90%的姿勢預測精度。因此，本次分子對接軟件選用了LeDock分子對接軟件。利用Uniprot PDB數據庫查找楓香脂作用于RA靶點的PDB格式，將mol2格式的楓香脂有效活性成分與PDB格式形式的靶點導入Ledock進行分子對接，通過所得Docking Score值分析對接分子與靶點之間的結合活性，分值越高說明分子與靶點的結合越牢固，并將對接結果以熱圖形式呈現。

2 結果

2.1 楓香脂的活性成分

TCMID、TCM-ID平臺及相關文獻記載，楓香脂化學成分有35種。臨床應用的楓香脂為陰干，而陰干的楓香脂樣品中不含(Z，Z)-2，5-十五烯醇[9]，故本次研究中去掉(Z，Z)-2，5-十五烯醇。根據口服生物利用度和類藥性指數篩選后符合標準有效活性成分有13種(見表1)。

表1 楓香脂的主要活性成分

2.2 活性成分作用靶點及RA作用靶點的獲取

從SwissTargetPrediction數據庫中得到與楓香脂活性成分相對應的靶點共479個，去重后288個，獲取116個RA疾病靶點，共同靶點27個，與這些靶點相對應的楓香脂的成分共8個(見表2)。

2.3 “成分-靶點”網絡構建

將楓香脂化學成分和楓香脂治療RA的靶點導入Gephi軟件，構建的“成分-靶點”網絡(圖1)，圖中含有35個節點，185條邊線。邊線代表活性成分與潛在靶標的相互關聯。可見，一種活性成分可以作用于多個靶點，同時多種成分也可作用于同一靶點。

2.4 靶點間相互作用網絡的構建

將楓香脂活性成分治療RA的27個靶點導入String數據庫獲取靶點間的相互作用關系，以excel格式下載靶點相互作用關系。將靶點相互作用鄰接表輸入Gephi軟件中，構建靶點間相互作用網絡(圖2)，其中包含18個節點，36條邊線。圖2中，圓形節點代表靶點，邊線代表靶標之間的相關性，節點面積的大小表示靶點的“度”值大小，節點面積越大，表示其“度”值越大。由圖可見，楓香脂治療RA的作用機制主要與JAK1、JAK3、MAPK14、PTGS2、PTPN11、PTPN2等靶點相關。

表2 楓香脂活性成分治療RA的靶點

圖1 楓香脂“成分-靶點”網絡

圖2 楓香脂-類風濕靶點互作用網絡

圖3 基于Metascape的富集分析

2.5 生物學功能與信號通路分析-富集分析

將楓香脂活性成分靶點中治療RA的27個靶點導入Metascape平臺，物種選為“sapiens”，進行“custom analysis”，顯示楓香脂治療RA的靶標顯著富集于白介素-2通路、細胞因子的產生、白介素信號、鈣離子運輸的調節、白細胞介素對氮化合物的反應、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節等通路及生物過程(圖3)。Metascape有去除冗余的功能，把功能相近的通路合成一個簇，展開分析包還發現白介素-6相關的信號通路、MAPK信號通路等主要信號通路包含在蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節簇里面。

2.6 分子對接

將mol2格式的M6、M8、M19、M23等4個主要活性成分和PDB格式的MAPK14、CTSK、G6PD、PTGS2等4個最重要的靶點，導入LeDock進行分子對接，同時將對接結果繪制成熱圖(圖4)，其中E64、SA、SB2、NAP分別是MAPK14、CTSK、G6PD、PTGS2等四個復合物中的配體。部分分子對接情況見圖5～8，圖5和圖6為分子對接3D展示圖，圖7和圖8為2D展示圖。由于PTPN2等靶點尚沒有配體結合結構，所以為提高對接結果的可靠性，本次只選擇了已有配體結合結構的靶點進行分子對接驗證。

3 討論

本研究對獲取的13種具有相關生物活性的化學成分進行分析，發現大多成分有抗菌、抗炎及止痛作用。(+)-2-bornanone具有殺蟲止癢、消腫止痛的功效[2]，ethyl iso-allocholate具有抗菌、抗炎活性[10]，terpinen-4-ol及其衍生物具有多種優良的生物活性，如殺蟲、殺螨、抗菌、抗癌、抗炎等[11]，α-terpineol的藥理活性主要有抗菌活性[12]、抗痙攣作用[13]、抗炎作用[14]。某些細菌或病毒可能借助菌體蛋白與RA病人自身蛋白的交叉免疫反應而致病[2]。故上述活性成分可能通過抑菌、抗炎、止痛作用參與對RA的治療。

圖4 熱圖

圖5 M8、M19與CTSK、G6PD、MAPK14在活性口袋內的姿態

圖6 M6、M19、M23與MAPK14、PTGS2在活性口袋內的姿態

圖7 M8、M19與CTSK、G6PD、MAPK14互作用的二維示意圖

圖8 M6、M19、M23與MAPK14、PTGS2互作用的二維示意圖

根據成分-靶點網絡與靶點相互作用網絡顯示的27個治療RA的靶點中，PLA2G1B、CTSK、MAPK14、G6PD、PTGS2等靶點與炎癥相關。Pla2g1b為疼痛反應調節相關基因[15]。前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)也被稱為COX-2，是前列腺素生物合成中的關鍵酶，在炎癥反應中發揮重要作用[16]。此外，G6PD是糖酵解途徑的關鍵酶，糖酵解活性的上調可導致RA患者關節滑膜增生、血管翳形成，加劇炎癥和骨質破壞，抑制糖酵解可以緩解滑膜細胞的炎癥反應[17]。由此推論，楓香脂經調控G6PD參與糖酵解過程，緩解滑膜細胞的炎癥反應，從而對RA起到治療作用。

富集分析結果顯示，楓香脂可通過多種通路、生物過程發揮治療RA的作用。有研究發現，IL-6也是RA關節損傷中的主要介質之一，在骨質破壞中也發揮重要作用。IL-6主要是由活化的單核細胞產生，可誘導 IL-17、IL-1、IL-2等其他炎性細胞因子的產生和釋放，并加強其炎癥破壞作用，同時誘導B淋巴細胞合成和分泌免疫球蛋白、類風濕因子[18]。另外，MAPK主要由細胞外信號調節激酶、c-Jun氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)、p38組成，在破骨細胞分化和存活中有重要意義。MAPK的幾條信號途徑在RA滑膜細胞中交叉起作用，并啟動基因轉錄，產生一系列炎性細胞因子、基質蛋白降解酶等刺激滑膜細胞增生，襯里層增厚及關節軟骨和骨組織的破壞，最終導致關節畸形[19]。CD4+T細胞介導的自身免疫反應在類風濕關節炎的發病過程中作用顯著。目前的研究普遍認為，CD4+T細胞可分為Thl及Th2兩種亞群，IL-2主要由CD4+T細胞的Thl亞群分泌，一旦機體發生Thl或Th2細胞占優勢時，可導致發生RA。也有文獻報道，若類風濕關節炎患者血清中IL-2水平升高,說明其血清中SB7-H3水平亦發生異常，從而使T細胞活化過度，最終導致分泌IL-2，從而影響類風濕關節炎的發生發展[20]。

將有效活性成分與參與度較高的靶點進行分子對接后顯示，M19與CTSK、G6PD、MAPK14、PTGS2，M8與G6PD、MAPK14，M6與PTGS2，M23與PTGS2配對評分較高，易于形成穩定的結合構象。提示這些成分在治療RA中具有重要作用，可作為未來楓香脂成分提取用于治療RA的研究對象。本研究單純從網絡藥理學角度來認識和了解楓香脂治療類風濕關節炎的作用機制，未能將網絡藥理學與動物/細胞實驗相結合，接下來還要對網絡藥理學所得結果與結論進行后續的實驗驗證。

本研究通過網絡藥理學研究、分子對接，闡述了楓香脂活性成分主要作用靶點以及相互作用途徑的特點。通過分析發現，楓香脂的(+)-2-bornanone、ethyl iso-allocholate、α-terpineol等13種成分通過PLA2G1B、MAPK14、CTSK、G6PD、PTGS2等靶點及白介素-2、白介素-6、MAPK等信號通路發揮作用。楓香脂對RA的治療體現了蒙藥多成分、多靶點、多途徑的特點，也符合多靶點聯合藥物治療RA的未來趨勢。最后，本次研究通過分子對接驗證了網絡藥理學數據的可靠性，對后續深入研究楓香脂治療RA的分子機制奠定了基礎。