化濕敗毒方治療新型冠狀病毒肺炎的藥理學(xué)機(jī)制探討和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

賴慶來，梁愛武，何妙儀，黃小玉，吳偉泳

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011

2019年底湖北省武漢市出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎(簡(jiǎn)稱新冠肺炎)的疫情，此次疫情比較嚴(yán)重，傳染性極強(qiáng)，傳染源主要為新型冠狀病毒感染患者和無癥狀感染者。2020年1月31日，世界衛(wèi)生組織正式將其命名為COVID-19[1]。國家衛(wèi)生管理部門采取重要措施，發(fā)布了COVID-19相關(guān)方診療方案，要求發(fā)揮中醫(yī)中藥治療和預(yù)防作用，并且加強(qiáng)中醫(yī)和西醫(yī)相互聯(lián)合治療作用，共同發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，使此次醫(yī)療救治取得最好效果。從中醫(yī)學(xué)角度分析，此次COVID-19病位主要在肺脾，病機(jī)特點(diǎn)主要以“濕、熱、毒”相關(guān)，根據(jù)病情特點(diǎn)提出分期辨證論治[2]。而中醫(yī)臨床具有辨證論治的特色優(yōu)勢(shì)，能夠因人制宜采取不同的治療措施。

化濕敗毒方是國家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)布的《新冠肺炎診療方案(試行第七版)》治療推薦方，用于COVID-19辨證為疫毒閉肺證的治療。該證臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、痰黃或痰中帶血、氣喘、乏力、口干苦、惡食欲差、大便不暢，小便短赤，舌紅、苔黃膩、脈滑數(shù)。化濕敗毒方在臨床中運(yùn)用效果明顯，目前此方已由黃璐琦院士為領(lǐng)隊(duì)的第一批國家援鄂抗疫中醫(yī)醫(yī)療隊(duì)(中國中醫(yī)科學(xué)院)研制成化濕敗毒顆粒。2020年3月18日，化濕敗毒顆粒獲臨床試驗(yàn)批件。化濕敗毒方傳承了中醫(yī)理論的精華，由麻杏石甘湯、藿香正氣散、宣白承氣湯、葶藶大棗瀉肺湯多個(gè)經(jīng)典名方加減而來。但化濕敗毒方對(duì)COVID-19的作用機(jī)制尚未能明確闡明，對(duì)化濕敗毒方的有效應(yīng)用帶來了局限。本研究對(duì)化濕敗毒方治療COVID-19的現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討，然后運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)化濕敗毒方治療COVID-19的作用機(jī)制研究，并借助分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為中醫(yī)藥治療COVID-19的研究提供進(jìn)一步科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化濕敗毒方現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制研究

查閱文獻(xiàn)以及臨床報(bào)道，總結(jié)化濕敗毒方治療COVID-19藥理學(xué)研究。

1.2 有效成分的收集及潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

以化濕敗毒方中單味中藥標(biāo)準(zhǔn)名稱為檢索詞，在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)數(shù)據(jù)庫檢索化濕敗毒方的全部化學(xué)成分，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)(ADME)：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選[3]，得到化濕敗毒方有效成分和相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。COVID-19靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，以“Novel Coronavirus Pneumonia”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，檢索出與COVID-19相關(guān)的基因。

1.3 化濕敗毒方治療COVID-19潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過R語言3.6.2程序取交集將藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得“化濕敗毒方”治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.4 交集靶標(biāo)的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作(PPI)構(gòu)建

為明確潛在作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫，物種僅限于“智人”，置信度>0.9為條件進(jìn)行篩選，獲得蛋白互作關(guān)系。通過Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建并可視化PPI交互網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)PPI中節(jié)點(diǎn)的平均“degree”值為最低標(biāo)準(zhǔn)篩選核心蛋白。

1.5 基因富集分析

為了深入了解化濕敗毒方治療COVID-19的生物過程及通路信息，利用R語言3.6.2程序基于“bioconductor”數(shù)據(jù)包提取信息，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO(geneontology)生物學(xué)過程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)通路富集分析，篩選條件設(shè)定閾值P<0.05，得到靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用。

1.6 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將收集的藥物，活性成分及收集的交叉靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.7.0軟件繪制“構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB ID：6LU7)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(ACE2)(PDB ID：1R42)的3D結(jié)構(gòu)PDB格式文件，利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載化濕敗毒方排名前三活性成分的3D結(jié)構(gòu)，使用Autodock-4.2軟件進(jìn)行。將蛋白導(dǎo)入，并對(duì)其加氫、加電荷等處理，然后將受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，最后利用PyMOL對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析及可視化。

2 結(jié)果

2.1 化濕敗毒方現(xiàn)代藥理學(xué)研究

雖然新冠肺炎的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但病毒感染及感染后的炎癥過程是明確的，因此,抗炎與抗病毒是治療的關(guān)鍵，化濕敗毒方由麻杏石甘湯、藿樸夏苓湯、宣白承氣湯、葶藶大棗瀉肺湯多個(gè)經(jīng)典名方加減而來，這些方劑大部分均有抗炎及抗病毒作用。

2.1.1 抗炎作用

相關(guān)研究研究表明，麻杏石甘湯可以減輕肺部炎癥，主要通過提高機(jī)體的免疫能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌相關(guān)方面，可以明顯改善流感病毒性肺炎小鼠的一般狀況[4]。化濕敗毒方中藿樸夏苓湯，在抗炎、調(diào)節(jié)免疫具有重要作用，研究表明，藿樸夏苓湯具有抑制炎癥作用，能降低TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的含量，抑制NF-κB炎癥通路的表達(dá)[5]。化濕敗毒方中宣白承氣湯有抗炎作用，可以改善重癥肺炎患者的白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，從而提高免疫功能，增強(qiáng)抗病能力[6]。葶藶大棗瀉肺湯可通過提高機(jī)體的免疫功能，減輕血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)水平的影響，從而減輕從而減輕肺部炎癥[7]。這些研究為化濕敗毒方抗病毒作用提供了依據(jù)。

2.1.2 抗病毒作用

化濕敗毒方中麻杏石甘湯具有抗炎，抗病毒和調(diào)節(jié)免疫功能等方面作用，麻杏石甘湯發(fā)揮抗病毒作用主要表現(xiàn)在能夠下調(diào)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞IFN-α、IFN-β分泌水平和蛋白表達(dá)水平[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，麻杏石甘湯里面不同的化學(xué)成分，作用在靶標(biāo)蛋白上，形成一個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)病毒入侵、病毒復(fù)制及繼發(fā)炎癥因子造成多器官損傷起作用，同時(shí)對(duì)侵襲過程進(jìn)行截?cái)啵哉{(diào)控宿主免疫進(jìn)行抗感染[9]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，藿樸夏苓湯中藿香，其主要活性成分有廣藿香醇、廣藿香酮，均具有顯著的抗炎、抗病毒作用，能很好抑制病毒的活性[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，藿樸夏苓湯通過菲酮、黃芩苷、酸棗仁皂苷等主要活性化合物，具有潛在的抗SARS-CoV-2作用，可能通過阻斷SARS-CoV-2病毒蛋白合成，起到抗病毒治療作用[11]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)了該方中的多個(gè)構(gòu)成方劑具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫的功能，是目前公認(rèn)的治療新冠肺炎療效確切的中藥方劑，這些研究為化濕敗毒方抗病毒作用提供了依據(jù)。

2.2 化濕敗毒方在治療COVID-19有效成分及其靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫最終篩選收集到化濕敗毒方藥物中13味藥(石膏未收集在數(shù)據(jù)庫內(nèi))，共有269個(gè)有效活性成分納入本次研究，其中麻黃23個(gè)、苦杏仁19個(gè)、廣藿香11個(gè)、厚樸2個(gè)、蒼術(shù)9個(gè)、草果8個(gè)、半夏13個(gè)、茯苓15個(gè)、大黃16個(gè)、黃芪20個(gè)、葶藶子12個(gè)、赤芍29個(gè)、甘草92個(gè)，部分關(guān)鍵活性化合物見表1。對(duì)這些藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去重后提取到靶點(diǎn)基因261個(gè)。

表1 化濕敗毒方部分活性化合物基本信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子號(hào)MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)類藥性DLMOL005190Eriodictyol71.790.24MOL004328Naringenin59.290.21杏仁AlmondMOL010921Estrone53.560.32MOL010922Diisooctylsuccinate31.620.23MOL00221111,14-Eicosadienoicacid39.990.20MOL002311Glycyrol90.780.67MOL004841LicochalconeB76.760.19MOL005017Phaseol78.770.58MOL007207Machiline79.640.24MOL012922l-SPD87.350.54藿香AgastacherugosaMOL002879Diop43.590.39MOL005890Pachypodol75.060.40MOL0059115-Hydroxy-7,4′-dimethoxyflavanon51.540.27MOL005916Irisolidone37.780.30MOL005918Phenanthrone38.700.33MOL005921Quercetin7-O-β-D-glucoside49.570.27厚樸MagnoliaMOL005970Eucalyptol60.620.32MOL005980Neohesperidin57.440.27蒼術(shù)AtractylodeslanceaMOL000173Wogonin30.680.23MOL000184Nsc6355139.250.76MOL000186Stigmasterol3-O-beta-D-glucopyranoside_qt43.830.76MOL0001883β-acetoxyatractylone40.570.22MOL000085Beta-daucosterol_qt36.910.75MOL000088Beta-sitosterol3-O-glucoside_qt36.910.75MOL000092Daucosterin_qt36.910.76MOL000094Daucosterol_qt36.910.76草果TsaokoMOL000073Ent-Epicatechin48.960.24MOL000074(4E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-4,6-dien-3-one67.920.24MOL000085Beta-daucosterol_qt36.910.75MOL000088Beta-sitosterol3-O-glucoside_qt36.910.75MOL000096(-)-Catechin49.680.24MOL000098Quercetin46.430.28半夏PinelliaMOL00175524-Ethylcholest-4-en-3-one36.080.76MOL002670Cavidine35.640.81MOL000449Stigmasterol43.830.76MOL00693610,13-Eicosadienoic39.990.20MOL00693712,13-Epoxy-9-hydroxynonadeca-7,10-dienoic42.150.24茯苓PoriacocosMOL000275Trametenolicacid38.710.80MOL0002767,9(11)-Dehydropachymicacid35.110.81

續(xù)表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子號(hào)MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)類藥性DLMOL000282Ergosta-7,22E-dien-3beta-ol43.510.72MOL000283Ergosterolperoxide40.360.81MOL000290PoricoicacidA30.610.76MOL000296Hederagenin36.910.75MOL000300Dehydroeburicoicacid44.170.83大黃RhubarbMOL002235Eupatin50.800.41MOL002251Mutatochrome48.640.61MOL002259Physciondiglucoside41.650.63MOL002260ProcyanidinB-5,3′-O-gallate31.990.32MOL002281Toralactone46.460.24MOL002280Torachrysone-8-O-beta-D-(6′-oxayl)-glucoside43.020.74MOL002293SennosideD_qt61.060.61MOL002303PalmidinA32.450.65MOL000471Aloe-emodin83.380.24黃芪AstragalusMOL000211Mairin55.380.78MOL000239Jaranol50.830.29MOL000296Hederagenin36.910.75 MOL000354Isorhamnetin49.600.31MOL0003713,9-Di-O-methylnissolin53.740.48MOL0003787-O-Methylisomucronulatol74.690.30MOL000392Formononetin69.670.21MOL000398Isoflavanone109.990.30MOL000422Kaempferol41.880.24MOL000439Isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole49.280.62MOL000098Quercetin46.430.28葶藶子LepidiaseedMOL00221111,14-Eicosadienoicacid39.990.20MOL000296Hederagenin36.910.75MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL003908Cynotoxin99.940.78赤芍RedPeonyMOL001918Paeoniflorgenone87.590.37MOL001925Paeoniflorin_qt68.180.40MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL004355Spinasterol42.980.76MOL000492(+)-Catechin54.830.24MOL006992(2R,3R)-4-methoxyl-distylin59.980.30MOL007003Benzoylpaeoniflorin31.140.54MOL007004Albiflorin30.250.77MOL0070148-Debenzoylpaeonidanin31.740.45MOL007022EvofolinB64.740.22

續(xù)表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子號(hào)MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)類藥性DLMOL007025Isobenzoylpaeoniflorin31.140.54MOL002883Ethyloleate(NF)32.400.19MOL005043Campest-5-en-3beta-ol37.580.71甘草 LicoriceMOL005012Licoagroisoflavone57.280.49MOL004948Isoglycyrol72.670.59MOL000098Quercetin46.430.28

2.3 COVID-19潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到COVID-19相關(guān)靶標(biāo)有251個(gè)。將化濕敗毒方和COVID-19潛在靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集共得到49個(gè)交叉靶點(diǎn)，即化濕敗毒方治療COVID-19潛在作用靶點(diǎn)(見圖1)。

圖1 化濕敗毒方與COVID-19靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)

化濕敗毒方PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。圖中共涉及個(gè)49節(jié)點(diǎn)、576條邊，其中節(jié)點(diǎn)越大度值越大，邊的粗細(xì)反應(yīng)連接評(píng)分，邊越粗評(píng)分越高，關(guān)系越密切，顏色由藍(lán)變黃程度與度值和介值均呈正相關(guān)。靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為12.25，超過平均度值的靶蛋白有20個(gè)，對(duì)排名前30的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制條形圖(圖3)。結(jié)果顯示IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA、CASP3等靶蛋白可能是化濕敗毒方防治COVID-19疾病的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 GO生物功能注釋及KEGG通路富集

利用R語言3.6.2程序基于bioconductor等數(shù)據(jù)包提取信息，設(shè)定閾值P<0.05，GO富集分析包括1 547條生物過程(biological process，BP)、29條細(xì)胞組分(cellular component，CC)以及86項(xiàng)分子功能(molecular unction，MF)。對(duì)排名前20的GO富集分析，如圖4(A-C)所示。

圖2 化濕敗毒方作用COVID-19交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 化濕敗毒方作用COVID-19關(guān)鍵核心靶蛋白

圖4 核心靶點(diǎn)的GO富集分析

BP分析(圖4A)可以看出，這些靶點(diǎn)主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)，細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程。

CC分析(圖4B)可以看出，靶點(diǎn)主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)、粘著斑等細(xì)胞組分。

MF分析(圖4C)中可以看出，靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、磷酸酶結(jié)合，BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合、死亡域、磷酸酶結(jié)合等分子功能。

根據(jù)設(shè)定閾值P<0.05為篩選條件，KEGG通路富集篩選得到156條信號(hào)通路，以富集基因數(shù)目進(jìn)行排序，排名前20的通路(如圖5)所示，主要富集在卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感、IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路等，這些通路發(fā)揮抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，說明化濕敗毒方主要活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的代謝通路，多成分、多靶點(diǎn)相互調(diào)節(jié)是治療COVID-19的可能機(jī)制。

圖5 核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.6 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將收集的藥物的活性成分及收集的交叉靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.7.0軟件繪制“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。如(圖7)所示，長方形代表化濕敗毒方預(yù)測(cè)靶點(diǎn)活性成分，橢圓形代表活性成分，節(jié)點(diǎn)之間的邊表示成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，以節(jié)點(diǎn)度值的平均數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)參考其中心度值，對(duì)化學(xué)成分和靶點(diǎn)進(jìn)行排序，其中排名較前主要核心化合物為：槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黃芩素等，靶點(diǎn)排名較前主要有IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA、CASP3等靶點(diǎn)。

圖6 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 化濕敗毒方有效成分作用于COVID-19 3CL水解酶及ACE2的分子對(duì)接結(jié)果

一般配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性大，一般以結(jié)合能(binding energy)≤-5.0 kJ/mol為篩選標(biāo)準(zhǔn)，本文將網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鏊枚戎蹬琶叭暮诵幕衔?因石膏未收集在TCMSP數(shù)據(jù)庫，此處將石膏有效成分碳酸鈣納入分子對(duì)接進(jìn)行篩選)與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果顯示(表2)，提示排名前三核心化合物與受體結(jié)合活性較高，對(duì)接情況(圖8)所示。并與目前臨床使用的抗病毒藥物洛匹那韋、瑞德西韋比較，其結(jié)合能未見顯著差異。由此可見這些核心化合物與受體蛋白形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。

表2 化濕敗毒方活性成分與3CL水解酶和ACE2的對(duì)接結(jié)果

圖7 化濕敗毒方核心活性化合物與3CL水解酶、ACE2的分子對(duì)接模式

3 討論

COVID-19為感受“疫癘”之邪而發(fā)生的一種急性傳染病，目前根據(jù)全國疫情流行情況，結(jié)合臨床癥狀分析可將COVID-19歸屬于中醫(yī)“疫病”范疇[2]。目前臨床COVID-19可分為輕型、普通型、重型、危重型四個(gè)分型，其中重型COVID-19的治療非常關(guān)鍵，是疾病好轉(zhuǎn)或者加重的分嶺點(diǎn)，如果不能及時(shí)有效治療可能發(fā)展為危重型，甚至出現(xiàn)死亡。重型COVID-19推薦使用化濕敗毒方治療，此方具有攻補(bǔ)兼施，扶正祛邪作用，發(fā)揮中醫(yī)扶正與祛邪治療的特點(diǎn)，有效緩解病情,最終達(dá)到治愈疾病的目標(biāo)[19]。中醫(yī)藥在治療傳染病中有較好的預(yù)防和治療作用，中醫(yī)藥以其獨(dú)特的療效起到重要作用，引起關(guān)注和肯定。在此次疫情防治工作中，中醫(yī)藥顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出化濕敗毒方核心化合物主要有槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黃芩素等。其中槲皮素度值最大，靶點(diǎn)數(shù)最多，說明其作用可能最顯著。槲皮素主要作用有消炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等藥理學(xué)作用，其作用機(jī)理主要阻止病毒受體復(fù)合物不能進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致病毒死亡[12]。木犀草素具有抗病毒、消炎、抗氧化等相關(guān)方面作用，相關(guān)動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素可減少腫瘤壞死因子α的釋放，同時(shí)還有抑制肺組織間的炎癥作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚能通過降低MAKP、NF-κB等通路的活性來抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等的相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平，起到抗炎作用[14]。漢黃芩素可抑制體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活，改善病毒導(dǎo)致急性肺部損傷的作用[15]。柚皮素作用功能多，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[16]。β-谷甾醇和黃芩素均具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫等藥理作用[17,18]。綜上化濕敗毒方的主要化合物基本都具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力的作用。

為了進(jìn)一步進(jìn)行分子對(duì)接以尋求化濕敗毒方治療COVID-19的物質(zhì)基礎(chǔ)，將排名前三的核心化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體進(jìn)行分子對(duì)接。而研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2是一種RNA冠狀病毒，其通過3CL水解酶，將病毒復(fù)制酶多聚蛋白轉(zhuǎn)化成功能蛋白[19]，而SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞主要依靠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體[20]，因此，通過抑制SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體有著重要的意義。從對(duì)接結(jié)合能和對(duì)接模式來看篩選的槲皮素、木犀草素、山奈酚化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2均有較好的結(jié)合，可能是化濕敗毒方防治COVID-19主要物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，槲皮素、木犀草素、山奈酚結(jié)合能與陽性對(duì)照藥洛匹那韋、瑞德西韋、利托那韋均較接近，進(jìn)一步證明化濕敗毒方活性成分與3CL水解酶及ACE2受體具有良好結(jié)合活性。

為了探討化濕敗毒方治療COVID-19分子機(jī)制，預(yù)測(cè)出的關(guān)鍵靶點(diǎn)有IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA等。研究表明，IL6、IL1B在RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)中，H1N1感染組中IL6I、L1B表現(xiàn)上調(diào)[21]。MAPK8和MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員之一，它們?cè)诎ㄑ趸瘧?yīng)激、病毒感染等相關(guān)內(nèi)環(huán)境應(yīng)激下被激活[22]。RELA是NF-κB的家族成員之一，RELA在中性粒細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著重要的作用[23]。所以化濕敗毒方可能調(diào)控這些細(xì)胞炎性因子以及相關(guān)趨化因子的活性，進(jìn)而影響炎性反應(yīng)。

從GO生物過程富集結(jié)果顯示化濕敗毒方治療COVID-19，主要涉及炎癥應(yīng)答、氧化還原過程、免疫應(yīng)答等生物過程，這些生物過程在化濕敗毒方治療COVID-19中起到了關(guān)鍵作用。KEGG通路富集主要涉及富集在卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感、IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路等，其中卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感等通路與COVID-19感染源相似，即病毒感染。而腫瘤壞死因子信號(hào)通路、白介素-17信號(hào)通路均是炎癥反應(yīng)中其重要作用的通路[24]。以上結(jié)果提示化濕敗毒方可能通過抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等途徑起到治療COVID-19的作用。

綜上所述，本研究基于現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討，然后運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)化濕敗毒方治療COVID-19的作用機(jī)制研究，并借助分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證，揭示了化濕敗毒方治療COVID-19“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的特點(diǎn)，但是由于網(wǎng)絡(luò)分析具有一定的局限性，對(duì)現(xiàn)階段對(duì)本病發(fā)生、進(jìn)展等機(jī)制機(jī)理的尚不清楚，仍然需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。