高效液相色譜法測(cè)定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量

張浩然 張亦菲 徐 汀 田 愷 華賢輝 黃家鶯*

（上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103）

美洛昔康屬于烯醇酰胺類非甾體抗炎藥，最早由勃林格殷格翰公司研制[1]。研究表明，美洛昔康對(duì)環(huán)氧化酶-2（COX-2）有選擇性抑制作用，解熱鎮(zhèn)痛及抗炎性作用較高，對(duì)胃腸道、腎臟副作用較低[2]，主要用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[3]、骨關(guān)節(jié)炎的治療[4]及術(shù)后止痛[5]。目前，對(duì)于美洛昔康的測(cè)定，主要有電化學(xué)法[6]和紫外分光光度法[7]，這兩種方法雖有一定的準(zhǔn)確性，但難以適應(yīng)大批量檢測(cè)。而液相色譜法較多報(bào)道于血清中美洛昔康的檢測(cè)[8-9]，且條件繁瑣。本文根據(jù)注射液的特點(diǎn)，建立了高效液相色譜法測(cè)定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量，該方法簡(jiǎn)單快速，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足質(zhì)量控制需求。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1100，安捷倫科技有限公司，Waters e2695，沃特世公司；電子天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；純水機(jī)：Molatom 1810A，中國(guó)重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 試藥

美洛昔康對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100679-201102，含量99.9%）；實(shí)驗(yàn)用水（電阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682 一級(jí)用水的規(guī)定）；醋酸銨（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；美洛昔康注射液（魯舍里樂藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)1801001、1801002 及1805003）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ODSC18色譜柱（柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm），以甲醇-0.lmol/L 醋酸銨溶液（1:1）為流動(dòng)相流動(dòng)相；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。典型色譜圖見圖1。

圖1 美洛昔康對(duì)照品的典型色譜圖

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備。精密量取本品適量，于容量瓶中，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1ml 中約含美洛昔康0.1mg 的溶液，搖勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備。取美洛昔康對(duì)照品50 mg，置50 mL 量瓶中，加1 mol/L 氫氧化鈉溶液4 mL，充分振搖3分鐘，加甲醇30 mL，渦旋3 分鐘，超聲處理10 分鐘，放冷。用50%甲醇溶液（V1∶V2）稀至刻度，搖勻，得到對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 對(duì)照品工作溶液。精密量取1 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1ml 中約含美洛昔康0.1mg 的溶液，搖勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，濾液作為對(duì)照品工作溶液。

2.3 供試品的測(cè)定

按照2.1 的色譜條件及2.2 的溶液制備方法，將供試品溶液和對(duì)照品工作溶液注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得美洛昔康的含量。

2.4 線性關(guān)系考察

美洛昔康對(duì)照品儲(chǔ)備液經(jīng)精密稀釋，制備60、80、100、120、160 μg/mL 的美洛昔康對(duì)照品系列溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)5 次進(jìn)樣，按照2.1 的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以美洛昔康對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x），以相應(yīng)濃度測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到方程為y=31361x+31140，相關(guān)系數(shù)為0.9999。說明美洛昔康濃度在60～160 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

隨機(jī)選取樣品，按照對(duì)照品添加量與待測(cè)成分量之比為0.8:1, 1:1, 1.2:1 進(jìn)行低、中、高三種不同濃度的準(zhǔn)確度試驗(yàn)，每個(gè)濃度3 份平行，按照2.1 的色譜條件及2.2 的制備方法進(jìn)行測(cè)定。平均回收率為97.4%，RSD 為0.9%，結(jié)果見表1。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照2.1 的色譜條件及2.2 的制備方法，對(duì)各批次樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，并記錄峰面積，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明（表2），各批次樣品的RSD為0.23%～0.25%，重復(fù)性較好。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

在不同時(shí)間，由不同的實(shí)驗(yàn)人員用不同的儀器對(duì)相同樣品進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。條件A：實(shí)驗(yàn)員甲，使用Agilent 1100 高效液相色譜儀，配Shiseido MG 色譜柱（C18，柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；條件B：實(shí)驗(yàn)員乙，使用Waters e2695 高效液相色譜儀，配Waters Symmetry 色譜柱（C18，柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）。選擇各批次樣品，按照上述A、B 不同條件進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明（表3），RSD 為0.19%～0.62%，中間精密度較好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

選取1801003 批次樣品，按照2.1的色譜條件及2.2 的制備方法配置3份平行樣品，進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，考察流速及柱溫對(duì)含量測(cè)定的影響。結(jié)果表明（見表4），流速在0.8～1.2 范圍內(nèi)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無影響；柱溫在35℃～45℃范圍內(nèi)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無影響。

2.9 供試品測(cè)定

采用本法，對(duì)供試品的含量進(jìn)行測(cè)定，并與生產(chǎn)企業(yè)提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，本方法測(cè)定美洛昔康注射液含量結(jié)果與生產(chǎn)企業(yè)提供的檢測(cè)結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將美洛昔康對(duì)照品儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋10 倍后，利用二極管陣列檢測(cè)器在190 nm～400 nm 范圍內(nèi)對(duì)美洛昔康進(jìn)行了紫外波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在270 nm 處有最大吸收，故確定270 nm為美洛昔康含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 對(duì)照品的預(yù)處理

據(jù)報(bào)道，二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康對(duì)照品[10]。二甲基甲酰胺作為助溶劑，對(duì)改善色譜峰型，平穩(wěn)基線有一定作用，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起許多問題。首先，二甲基甲酰胺可引起人體消化道紊亂，肝臟和腎臟損害，長(zhǎng)期接觸，會(huì)損害試驗(yàn)人員的身體健康[11]。其次，二甲基甲酰胺作為一種特殊的溶劑，會(huì)對(duì)色譜柱造成損傷[12]，進(jìn)而降低色譜柱的柱效及理論塔板數(shù)，不利于檢測(cè)任務(wù)的長(zhǎng)期重復(fù)進(jìn)行。本文采用甲醇超聲助溶，并用50%甲醇定容稀釋，對(duì)美洛昔康的溶解效果好。在保證方法穩(wěn)定可靠的同時(shí)，將試驗(yàn)對(duì)人員健康和色譜柱的潛在危害降至最低。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表（n=6）

表3 中間精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)表（n=12）

表4 耐用性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表（n=3）

本方法簡(jiǎn)便快捷，具有較好的準(zhǔn)確度及精密度，能夠滿足對(duì)美洛昔康注射液質(zhì)量控制的需求。

表5 含量測(cè)定試驗(yàn)數(shù)據(jù)表（n=3）

% % 1801001 1801002 1801003 106.30.18100.60.15106.00.27106.60.16100.40.19105.70.23-0.30.20.3

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