鎂表面載地塞米松DNA凝膠促成骨細胞分化研究

閆寧 宋文 李哲 張玉梅

金屬鎂由于其良好的生物相容性和生物可降解性，可以彌補常規不可吸收引導骨再生(GBR)屏障膜需二次手術取出的不足，以及可吸收膜機械性能差的缺點[1-2]。然而鎂表面成骨誘導能力不足，用鎂膜作為GBR膜難以發揮足夠的引導作用[3]。大量研究在鎂表面加載生物活性涂層或者活性藥物、因子提高誘導成骨作用，增強GBR膜材料成骨效能[4]。地塞米松(DEX)是一種常用作體外誘導骨髓間充質干細胞成骨分化的抗炎糖皮質激素，具有誘導細胞堿性磷酸酶(ALP)表達的能力[5]，近年來熱門的DNA水凝膠在生物相容性優異，有著良好的藥物負載能力，可以作為藥物的輸送載體[6]。本研究在鎂表面加載含有DEX的DNA水凝膠涂層，提升鎂表面成骨誘導能力。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑與儀器

方形純鎂片(邊長1 cm，廣州鎂業);碳化硅砂紙400～3 000 目(勇士,德國); 丙酮、無水乙醇、氫氧化鈉(北京國藥)；鮭魚精DNA、地塞米松、4%多聚甲醛(北京索萊寶)；納米硅酸鹽(nSi，Laponite XLG，Nanocor，美國)；成骨細胞前體細胞MC3T3-E1 (ATCC，美國)，ɑ-MEM培養基、胎牛血清(Hyclone，美國)；CCK-8試劑盒(上海七海生物)；BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒、ALP定量試劑盒(北京碧云天)；Prime ScriptTMRT Mater Mix、TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Takara，日本)。

陽極氧化電源(香港龍威)；全波長酶標儀(BioTek，美國)；渦旋混勻儀主動(廣州科適特)；冷凍干燥機(SIM，美國)；場發射掃描電鏡(Hitachi，日本)；CFX96實時熒光定量 PCR儀 (Bio-Rad，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 鎂基底的預處理 對純鎂片依次使用400～3 000 目的砂紙逐級打磨拋光，并依次在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗。在電解液為120 g/L的NaOH溶液中進行恒定電壓40 V，時間為1 h的陽極氧化反應，后進行450 ℃、恒溫6 h的退火處理。

1.2.2 DNA凝膠的制備 將鮭魚精DNA常溫溶解于超純水中，制備成濃度為4%w/v的DNA溶液，37 ℃恒溫保持2 d，使其充分溶解，后將DNA溶液加熱至90 ℃， 1 min后置于37 ℃環境下冷卻2 h來形成預凝膠。將納米硅酸鹽(nanosilcate,nSi)與DEX分散體混合添加至DNA預凝膠中，混合渦旋5 min，使nSi與DEX終濃度達到0.5%與0.5 mg/ml。各取200 μl混合物均勻滴加在預處理的鎂基底表面， 37 ℃過夜以完全凝膠化。使用掃描電鏡觀測冷凍干燥表面噴金后的DNA預凝膠與添加nSi的DNA終凝膠表面形貌，以及復合材料縱切后的截面形貌。

1.2.3 地塞米松釋放 用 PBS配置含有不同DEX濃度(0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0 mg/ml)的標準液，檢測240 nm波長的吸光度，線性擬合出DEX濃度的標準曲線。將涂覆有200 μl的0.5 mg/ml DEX濃度的DNA預凝膠與終凝膠裝入15 cm透析袋中，兩端密封后，浸入50 ml PBS溶液的離心管中， 37 ℃恒溫振蕩，在第1～15 天內每天取 1 ml透析液，測量240 nm波長處的吸光度，計算DEX釋放量與總釋放比率，后補充等量 PBS，整個實驗持續到釋放水平達到穩定。

1.2.4 細胞培養 實驗細胞選擇為小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞，以4×104個/ml的細胞密度接種在12 孔Transwell小室的下室，培養基為10% FBS的α-MEM培養基，隔日換液。各組材料置于上室，在5% CO2孵箱中， 37 ℃條件下恒溫培養。

1.2.5 CCK-8測定細胞毒性 細胞培養后的第3 天用 PBS 漂洗下室細胞，每孔加入550 μl CCK-8檢測混合液，置于37 ℃條件下恒溫孵育3 h后取出，用分光光度計測定450 nm波長處的吸光度，計算平均值。

1.2.6 ALP染色和定量分析 細胞培養24 h后更換為成骨誘導培養液，每2 d換液。在成骨誘導7 d后，PBS漂洗下室細胞3 次后， 4%多聚甲醛固定20 min，使用BCIP/NBT顯色試劑盒進行染色，避光孵育2 h， PBS漂洗3 次后拍照。成骨誘導7 d后，使用50 μl的0.2%Triton X-100對細胞進行低溫裂解充分后，120 00 r/min高速離心15 min，使用ALP活性試劑盒對上清液中酶濃度進行檢測，并測量在520 nm波長處的吸光度數值，計算平均值。

1.2.7 PCR檢測細胞成骨相關基因 成骨誘導7 d后，使用Trizol裂解提取RNA，按照Prime ScriptTMRT Master Mix和TB GreenTMPremix Ex TaqTM操作說明進行逆轉錄，使用CFX96 實時熒光定量 PCR 儀進行RT-qPCR反應，檢測 Runx2和BMP2的mRNA表達水平，GAPDH作為內參[7]。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 DNA水凝膠的制備與表征

凝膠涂層表面形貌見圖 1A，DNA預凝膠具有高度多孔、孔徑更大的互連結構； nSi加入后的DNA終凝膠孔徑更小，平均孔徑從216.2 μm顯著降低到了26.8 μm。最終制備的復合材料截面形貌見圖 1B)，鎂基底陽極氧化后產生了分界清晰的MgO氧化層，其通過微裂隙與微孔的機械嵌合作用使最表面多孔的DNA水凝膠涂層結合更為緊密。

2.2 地塞米松加載和釋放特性

DEX濃度標準曲線見圖 2A，擬合的吸光度線性回歸方程為y=0.4404x+3.458， R2=0.982。DNA預凝膠、終凝膠的體外DEX釋放曲線見圖 2B， 15 d內的DNA預凝膠中藥物釋放速率較快，藥物釋放的半衰期大約為2.5 d左右， 最終在12 d左右時藥物釋放完畢。DNA終凝膠由于它更為緊湊的結構和更小的孔徑，藥物釋放時間延長，半衰期約為5 d左右，而大約需要15 d藥物完全釋放完畢。

2.3 修飾后鎂表面細胞相容性

圖1 DNA預凝膠與終凝膠表面形貌(A)與復合材料截面形貌(B) (×5 000)

Fig 1 Surface morphology of DNA pregel and final gel (A) and cross-sectional morphology of the composite materials(B) (×5 000)

圖2 DEX標準曲線(A)與體外釋放曲線(B) 圖 3 MC3T3-E1的細胞增殖(CCK-8實驗)

Fig 2 DEX standard curve(A)andinvitrorelease curve(B) Fig 3 Proliferation of MC3T3-E1(CCK-8 assay)

圖4 MC3T3-E1 細胞的ALP染色 (ALP, ×100)

Fig 4 ALP staining of MC3T3-E1 cells (ALP staining, ×100)

第3 天CCK-8測量的MC3T3-E1細胞的活性如圖 3顯示，MgO組的細胞活力高于光滑的Mg組(P<0.01)，而DEX@DNA-MgO組的細胞活性較Mg組與MgO組都有了更為顯著的升高(P<0.01)。

2.4 修飾后鎂表面促進細胞成骨分化

7 d后ALP染色結果見圖 4， Mg組只有散在ALP結晶， MgO組染色程度較深，但這2 組無明顯差異， 而DEX@DNA-MgO組染色面積最大，且相互交聯，該組表達了最高的ALP活性(P<0.01)。

圖5顯示， MC3T3-E1細胞在成骨誘導7 d后MgO組與Mg組的Runx2和BMP2表達水平并未見明顯差異(P>0.05)，DEX@DNA-MgO組表達水平都有顯著性的提高(P<0.01)。

3 討 論

近年來，金屬鎂由于具備良好的機械強度、生物相容性及生物可降解性等優勢，被學者們逐漸應用于GBR膜材料中。提升鎂表面主動誘導骨形成的能力，在鎂表面構筑生物活性涂層是研究的主流方向。

圖 5 MC3T3-E1 細胞中Runx2、BMP2的mRNA表達水平

Fig 5 The mRNA expression of Runx2 and BMP2 of MC3T3-E1 cells

本研究對純鎂進行陽極氧化后退火處理，表面形成MgO涂層[8]，其微孔裂隙的存在可以進一步與加載的生物涂層機械嵌合[9]。DNA水凝膠是近些年來發展迅速的藥物轉運載體，具有序列可操縱性和優良的生物相容性，可用于智能的藥物遞送[10]。大多數DNA水凝膠的合成方法中，需要引入額外的官能團或其他聚合物[11]，這可能會帶來生物安全問題。Basu等[12]通過簡單的靜電結合的相互作用使DNA形成物理交聯網絡，具有獨特的優勢。本實驗采用的成膠過程通過加熱冷卻使DNA變性再雜交，游離的堿基對使相鄰 DNA氫鍵互補形成預凝膠；納米硅酸鹽 nSi表面電荷的各向異性可以與磷酸基團靜電結合成膠，在掃描電鏡下觀察，成膠后孔徑更小，形成更為致密的交聯網絡，更有利于藥物的封閉保存，因此在DEX藥物的釋放實驗中，加入nSi的 DNA終凝膠表現出了很好的緩釋作用，證明材料可以在骨缺損修復的進程中發揮持久的促成骨作用。

在體外細胞培養的CCK-8實驗中，MgO組較Mg組對細胞有一定促增殖作用(P<0.01)，但單純形貌改變的作用十分有限，DNA水凝膠的加載使細胞活性進一步明顯增高(P<0.01)，證明了DNA水凝膠作為人體遺傳物質，擁有更好的生物相容性。PCR檢測成骨基因Runx2和BMP2表達、ALP染色和定量分析上，MgO組均未表現明顯的促成骨分化能力(P>0.05)，而DNA水凝膠涂層組別都有著顯著提升(P<0.01)。這說明DEX的加載大幅度提高了輔助誘導成骨的潛能，適合作為鎂應用于GBR膜材料的輔助生物活性藥物。

綜上所述，在純鎂陽極氧化預處理的MgO 基底上，通過靜電結合形成的DNA納米復合水凝膠有著致密緊湊的結構與良好的DEX緩釋效果，與MC3T3-E1細胞表現出良好的細胞相容性，可促進ALP的合成以及Runx2與BMP2基因的表達，為鎂材料提供了更好的主動誘導成骨能力，為GBR膜材料的應用打下基礎。