蝗蟲微孢子蟲（Nosema locustae）對環(huán)境非靶標有益生物的毒性效應

袁善奎，蔣金花，張 龍，吳聲敢，柳新菊，安雪花，李 崗

（1.農業(yè)農村部農藥檢定所，北京 100125；2.浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所，杭州 310021；3.中國農業(yè)大學，北京 100193）

隨著化學農藥環(huán)境污染問題的日益凸顯，微生物農藥以其選擇性強、來源廣泛、對人畜低毒、不易產生抗性、能兼顧生態(tài)平衡等優(yōu)勢受到了越來越多的關注。微生物農藥主要是指用于防治危害農作物的病、蟲、草、鼠害及促進作物生長的活體微生物[1]，主要包括細菌、真菌、病毒、線蟲及原生動物等[2-3]。其中可利用的原生動物類微生物農藥主要為微孢子蟲，約有200種，常用的有蝗蟲微孢子蟲、玉米螟微孢子蟲和樅色卷葉蛾微孢子蟲等。此類農藥在防治棉鈴蟲、蝗蟲、松毛蟲上均有應用。蝗蟲微孢子蟲（Nosema locustae）是蝗蟲等直翅目昆蟲的專性寄生的單細胞真核原生動物，由Canning[4]于1953年從非洲飛蝗體內分離鑒定并命名，并在長期的劑型研究與蟲害防控中，其應用技術逐漸得以成熟發(fā)展，在控制草地蝗蟲方面取得了良好的效果[5-9]。

由于微生物農藥在應用中可能通過直接在水體表面施用或土壤徑流、感染微生物的昆蟲的遷移等途徑進入環(huán)境，不可避免地會與環(huán)境非靶標有益生物暴露接觸。為更好地評估蝗蟲微孢子蟲的環(huán)境暴露風險，本研究按照NY/T 3152—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則》[10-14]要求，選取了5種典型的環(huán)境生物日本鵪鶉、意大利蜜蜂、家蠶、大型溞和斑馬魚為試驗對象，以探究蝗蟲微孢子蟲對典型環(huán)境生物的毒性效應和安全風險，為該產品的安全應用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生物

鳥類毒性試驗：日本鵪鶉（Coturnix japonica），日本鵪鶉種蛋購自山東省日照市東港區(qū)老孟孵化場，于本單位實驗室孵化后用于試驗。

蜜蜂毒性試驗：意大利蜜蜂（Apis mellifera），購自浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂廠，在本單位空地上馴養(yǎng)后用于試驗。

家蠶毒性試驗：家蠶（Bombyx mori），品種為“皓月×菁松”，蠶種由浙江省蠶種質量檢驗檢疫站提供，催青孵化至二齡起蠶后用于試驗。

溞類毒性試驗：大型溞（Daphnia magna），其親溞由沈陽化工研究院有限公司安全評價中心提供，于本單位實驗室繁殖后用于試驗。

魚類毒性試驗：斑馬魚（Brachydanio rerio），AB型品系，種魚購自武漢中科院水生生物研究所的國家斑馬魚資源中心，于本單位實驗室繁殖后用于試驗。

1.1.2 供試微生物農藥

供試微生物農藥為0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑，由南通德益化工有限公司生產并提供。

1.2 試驗條件

各環(huán)境生物毒性試驗條件如表1所示。

表1 不同非靶標生物的試驗條件

1.3 試驗方法

1.3.1 鳥類毒性試驗

根據(jù)中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 3152.1—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則第1部分：鳥類毒性試驗》[10]，試驗按照最大危害暴露量要求設置1.0×108孢子/kg體重共1個試驗劑量（被試物直接經(jīng)口暴露，即被試物所能配制的最大劑量），同時設置滅活對照組和空白對照組。

試驗時，按照每100 g體重日本鵪鶉灌喂0.5 mL試驗溶液進行，連續(xù)經(jīng)口暴露5 d。每組用日本鵪鶉雌雄各10只，飼養(yǎng)空間不小于300 cm2/鳥，2 h中毒癥狀調查后按常規(guī)方法喂食。處理組、滅活對照組和空白對照組同時進行。處理后，每天觀察并記錄受試日本鵪鶉中毒與死亡癥狀，同時記錄死亡數(shù)，死亡數(shù)累計計算。

1.3.2 蜜蜂毒性試驗

根據(jù)中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 3152.2—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則第2部分：蜜蜂毒性試驗》[11]進行最大危害暴露量試驗（被試物所能配制的最大劑量），同時設置滅活對照組和空白對照組。

蜜蜂接觸毒性試驗：取0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑10 mL，與100 μL杰效利混勻作為接觸試驗的處理溶液（被試物所能配制的最大劑量）。采用“點滴法”進行暴露。點滴前，先用CO2麻醉試驗蜜蜂，然后用手動微量點滴儀對準蜜蜂中胸背板處點滴處理藥液或滅活對照藥液1 μL/蜂，待藥液揮發(fā)后將蜜蜂移入蜂籠中，用脫脂棉浸泡適量50%蔗糖水（W/W），通過網(wǎng)眼供蜜蜂攝食。空白對照組直接飼喂50%蔗糖水，處理組和對照組均設3個重復，每個重復20只蜜蜂。處理后，每天觀察并記錄供試蜜蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)。

蜜蜂經(jīng)口試驗：取0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑2.0 g與2.0 g蔗糖混勻，作為經(jīng)口試驗的處理溶液（被試物所能配制的最大劑量）。在飼喂器（一次性塑料滴管）中加入400 μL處理藥液或滅活對照藥液，對蜜蜂進行飼喂。暴露4 h后，測定每組試驗溶液的消耗量，并將飼喂器取出，換用不含被試物的50%蔗糖水進行飼喂。處理組和對照組均設3個重復，每個重復20只蜜蜂。處理后，每天觀察并記錄供試蜜蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)。

1.3.3 家蠶毒性試驗

根據(jù)中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 3152.3—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則第3部分：家蠶毒性試驗》[12]進行試驗，試驗按照最大危害暴露量要求設置0.2億孢子/mL共1個試驗劑量（被試物直接浸漬桑葉，即被試物所能配制的最大劑量），同時設置滅活對照組和空白對照組。

試驗時，將2 cm×2 cm左右的桑葉約5.0 g放入保鮮袋中，加入濃度為0.2億孢子/mL的試驗藥液5.0 mL，桑葉充分浸潤藥液后取出自然晾干后，分成4等份轉入培養(yǎng)皿中。將二齡起蠶挑入培養(yǎng)皿中，每皿20頭，并蓋上蓋子，于植物培養(yǎng)箱內飼養(yǎng)，各處理設4個重復，每一培養(yǎng)皿為一重復。試驗組和對照組同時進行。喂食染毒桑葉24 h后，轉入干凈的培養(yǎng)盒內每天用不含被試物的桑葉正常飼喂。給藥后，每天觀察并記錄家蠶的中毒癥狀和死亡情況。上簇第8天采繭調查幼蟲死亡數(shù)、死籠數(shù)、結繭數(shù)、全繭量和繭層量等。計算家蠶幼蟲死亡率、結繭率、繭層率及化蛹率。

1.3.4 溞類毒性試驗

根據(jù)中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 3152.5—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則第5部分：溞類毒性試驗》[13]進行試驗，試驗按照最大危害暴露量要求設計1.0×106孢子/mL共1個試驗濃度，同時設置滅活對照組和空白對照組。

試驗時，將50 mL試驗溶液加入到結晶皿（直徑60 mm）中，然后用滴管加入試驗用溞，每皿5只，蓋上結晶皿蓋后放入光照培養(yǎng)箱。處理組和對照組均設4個平行，每皿為1個平行。試驗組和對照組同時進行。試驗期間，每天喂新鮮濃縮的羊角月芽藻藻液，每隔3 d更換試驗溶液。試驗持續(xù)21 d，每天觀察并記錄大型溞受抑制數(shù)和中毒癥狀。

1.3.5 魚類毒性試驗

根據(jù)中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 3152.4—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則第4部分：魚類毒性試驗》[14]進行試驗，試驗按照最大危害暴露量要求設計1.0×106孢子/mL共1個試驗濃度，同時設置滅活對照組和空白對照組。

試驗時，將斑馬魚加入到濃度為1.0×106孢子/mL蝗蟲微孢子蟲的試驗溶液中，每燒杯10尾魚，各處理設4個重復，每杯為1重復。試驗組和對照組同時進行。試驗期間，每天飼喂2次豐年蝦，每隔3 d更換試驗溶液。試驗持續(xù)30 d，每天觀察并記錄斑馬魚的飼料食用情況、中毒癥狀和死亡情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用DPS軟件對試驗溶液處理組、滅活對照組和空白對照組進行差異顯著性分析，并以此評估最大危害暴露量下0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對不同生物的影響。

2 結果與分析

2.1 鳥類毒性試驗

試驗期間，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理組、滅活對照組和空白對照組的日本鵪鶉均未出現(xiàn)死亡，且各處理日本鵪鶉均表現(xiàn)正常。表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對日本鵪鶉無致死毒性。

2.2 蜜蜂毒性試驗

蜜蜂接觸試驗中空白對照組和滅活對照組的蜜蜂平均死亡率分別為1.67%和0，蜜蜂經(jīng)口試驗中空白對照組和滅活對照組的蜜蜂平均死亡率均為1.67%（表2和表3），符合NY/T 3152.2—2017《微生物農藥環(huán)境風險評價試驗準則第2部分：蜜蜂毒性試驗》中的質量控制要求，即空白對照組受試蜜蜂死亡率不得超過20%，表明本試驗有效。

蜜蜂接觸試驗中，空白對照組、滅活對照組和被試物處理組蜜蜂的平均存活率分別為98.3%、100%和100%。在蜜蜂經(jīng)口試驗中，空白對照組、滅活對照組和被試物處理組蜜蜂的平均存活率分別為98.3%、98.3%和91.7%。t檢驗結果顯示，蜜蜂接觸試驗中t=-1，P＞0.05。蜜蜂經(jīng)口試驗中t=-2.16，P＞0.05（表2和表3），表明蜜蜂接觸試驗和經(jīng)口試驗的被試物處理組與其對應的對照組之間無顯著性差異。因此，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對蜜蜂無致死毒性。

2.3 家蠶毒性試驗

經(jīng)0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理后，各處理對家蠶的影響如下：

對家蠶幼蟲的影響：處理組、滅活對照組和空白對照組的家蠶幼蟲均表現(xiàn)正常，且均未出現(xiàn)死亡，即受試家蠶的死亡率均為0，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對家蠶無致死毒性。

表2 0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對蜜蜂接觸毒性試驗結果

表3 0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對蜜蜂經(jīng)口毒性試驗結果

對家蠶化蛹率的影響：空白對照組、滅活對照組和處理組的家蠶化蛹率分別為97.5%、96.2%和93.8%。差異顯著性分析表明，處理組家蠶化蛹率與空白對照組、滅活對照組之間均無顯著性差異（表4）。

對家蠶產繭量的影響：空白對照組、滅活對照組和處理組的家蠶全繭量平均值分別為1.836 9 g、1.846 6 g和1.878 8 g；繭層量平均值分別為0.380 3 g、0.374 3 g和0.379 7 g；繭層率平均值分別為20.85%、20.44%和20.41%。差異顯著性分析表明，處理組家蠶全繭量、繭層量和繭層率與空白對照組、滅活對照組之間相比均無顯著性差異（見表5）。

表4 0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對家蠶生長發(fā)育、結繭率及化蛹率的影響

表5 0.2億孢子/毫升蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對家蠶產繭量的影響

2.4 溞類毒性試驗

試驗期間，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理組、滅活對照組和空白對照組的大型溞均未出現(xiàn)中毒癥狀。處理組、滅活對照組和空白對照組的大型溞活動抑制率均為0，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對大型溞無致死毒性。

2.5 魚類毒性試驗

試驗期間，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理組、滅活對照組和空白對照組斑馬魚的死亡率均為0，并且斑馬魚取食正常，無中毒癥狀，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對斑馬魚無致死毒性。

3 結論與討論

本研究選取了5種典型的環(huán)境生物鳥、蜜蜂、家蠶、溞、魚，通過最大危害劑量試驗探究了0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對環(huán)境生物的毒性和安全風險。研究發(fā)現(xiàn)，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量條件下對鳥、蜜蜂、家蠶、溞、魚均無致死毒性，并且對家蠶結繭數(shù)、化蛹率、全繭量、繭層量、繭層率等指標均無顯著性差異影響，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對供試環(huán)境有益生物安全。

蝗蟲微孢子蟲主要通過感染寄主脂肪細胞，釋放出孢原質裂殖增殖，產生新一代孢子，嚴重受感染的脂肪體可完全被孢子取代。寄主由于喪失脂肪體，以致取食和活動減少，發(fā)育延滯，蛻皮困難，產卵減少，最后死亡。蝗蟲微孢子蟲作為疾病可以通過健蟲與病蟲的相互殘食、取食孢子污染的食物等自然水平傳播方式，也可通過母帶直接將該病傳播給子代的垂直傳播方式，在蝗蟲種群中傳播、流行[14-15]。故研究蝗蟲微孢子蟲對環(huán)境生物脂肪體的影響，有利于更好地探究蝗蟲微孢子蟲對環(huán)境生物的毒性及其致毒機制。研究發(fā)現(xiàn)，微生物農藥在環(huán)境和有機體內存在一個增值的過程，除了對生物體的致死毒性，更多表現(xiàn)在致病性和對后代的影響。因此，進一步深入開展蝗蟲微孢子蟲等微生物農藥在環(huán)境生物親代和子代中的繁殖毒性，比如鳥類繁殖毒性、蜜蜂幼蟲毒性、大型溞和魚類繁殖毒性等有利于更好地評估微生物農藥的環(huán)境風險。

目前，我國已發(fā)布實施了微生物農藥對魚類、鳥類、蜜蜂、家蠶、藻類、溞類等6項毒性試驗的農業(yè)行業(yè)標準，以及微生物農藥環(huán)境增殖試驗準則3項（水、土壤、葉面），尚缺乏微生物農藥環(huán)境風險評估程序類的標準[16]。由于微生物農藥是活的生物體，通常采用發(fā)酵或培養(yǎng)的技術進行生產，因此給產品質量控制帶來困難，不同批次的產品質量差異較大，并且微生物菌種經(jīng)過長期培養(yǎng)后還存在退化和變異的問題。因此，應對微生物農藥進行深一步的環(huán)境毒理學研究，關注長期生產鏈和應用鏈，以及完善后期風險評估程序，推進微生物農藥產業(yè)的健康發(fā)展。