甘肅黨參急性青枯型根腐病病原鑒定與室內毒力測定研究

孫新榮，張西梅，仲彩萍*，胡小平，高薇薇，李鵬霞，漆文選

(1.渭源縣農業技術推廣中心，甘肅 渭源 748200；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西 楊凌 712100；4.渭源縣種子管理中心，甘肅 渭源 748200)

黨參(Codonopsispilosula(Franch)Nannf.)為桔梗科多年生纏繞或直立草本植物。甘肅定西是著名的千年藥鄉，是全國藥材的重要主產區之一。定西市渭源縣2002年被中國農學會特產之鄉組委會正式命名為“中國黨參之鄉”，所產黨參以“條直、體胖、色白、質好”而著稱。目前，發展黨參藥材產業成為定西地區重要的扶貧途徑。但隨著種植面積的不斷擴大，病害問題已逐漸成為影響黨參產量和品質的重要因素之一。據2013-2017年調查發現，黨參大田出現大面積的莖葉急性青枯、爛根現象，當地藥農俗稱“紅芯病”或“黃芯病”，發病率達15%～70%；輕則影響商品價值，重則整片青枯死亡，嚴重減產，減產幅度10%～60%，是目前最嚴重的病害之一。王艷等[1]調查研究表明甘肅黨參根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。然而，至今關于黨參“紅芯病”或“黃芯病”新型根腐病的發病癥狀、流行時期及主要病原菌尚不明確，相關防治技術帶有盲目性。因此，筆者通過系統調查黨參“紅芯病”或“黃芯病”新型根腐病田間發病情況及癥狀表現，對病原菌進行分離鑒定并篩選效果較好的防治藥劑，以期為脫貧攻堅黨參產業可持續發展保駕護航。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2013-2017年，每年4-9月于甘肅黨參主產區定西市渭源、隴西、臨洮等縣黨參“紅芯病”或“黃芯病”發生嚴重的大田，采集病害標本，觀察并記錄病害相關的癥狀。

1.2 病原菌分離培養

采用常規組織分離法分離病原菌[2]，選取新發病參根病健交界處組織(3 mm×3 mm)，先用70%乙醇消毒5 s，0.1%HgCl2表面消毒30 s，無菌水沖洗3～4次，然后在無菌條件下接種于馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose ager，PDA)平板上，于25℃恒溫箱內暗培養。對獲得的菌落進行單孢分離純化，將純化好的菌株接種于PDA斜面培養基上，4℃保存。

1.3 病原菌致病性測定

采用灌根接種法[2]對分離物進行致病性測定。將分離物接種于PDA平板上，25℃恒溫箱內培養4 d后，用無菌水沖洗孢子，配制成濃度為1×106個·mL-1的孢子懸浮液，備用。選取健康一年生黨參苗，種植于含無菌土的花盆中，出苗20 d后，在距蘆頭4 cm的參根部位用滅菌針刺傷表皮，立即灌根50 mL孢子懸浮液作為刺傷接種處理，同時設無傷接種處理，以接種相同體積的無菌水作為對照。每個處理接種3盆，每盆種植10株黨參。灌根后的黨參置于25 ℃人工氣候箱培養，定期觀察并記錄發病情況。同時，對典型發病植株進行再分離，將分離物與初始接種體進行形態學比較。

1.4 病原菌形態學鑒定

將病原菌接種到PDA培養基平板中央，在25 ℃的恒溫箱中暗培養，觀察菌落生長速度、色澤等形態特征，并挑取菌絲體制成玻片，在顯微鏡下觀察孢子的顯微特征，并測量分生孢子大小。

1.5 病原菌分子鑒定

病原菌的分子生物學鑒定委托中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所、西北農林科技大學植物保護學院完成。

1.5.1 DNA提取以及病原菌ITS序列擴增及測序 參照申永銘等[3]的方法。PCR產物送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序。

1.5.2 數據分析 將測序結果進行BLAST比對分析。從GenBank下載鐮刀菌屬代表種序列，將序列信息導入MEGA(6.0)采用Clustal W方法進行序列比對，通過最大擬然法(Maximum Likelihood Tree)構建系統發育樹，同時利用Bootstrap(10 000次重復)檢驗各分支的置信度。

1.6 室內毒力測定

采用生長速率法進行室內毒力測定。供試藥劑共7種，采用梯度稀釋法配成不同稀釋倍數(18%噻靈·咯·精甲、6.25%精甲·咯菌腈、25 g·L-1咯菌腈、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈的稀釋倍數為100 000、150 000、200 000、250 000、300 000倍；80%乙蒜素為4 000、8 000、12 000、16 000、20 000倍；60.0052%噁霉靈·乙酸為400、800、1 200、1 600、2 000倍)的含藥PDA培養基，以不加藥劑為對照；將藥劑稀釋倍數換算為相應的室內毒力測定濃度見表1。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

采用DPS軟件計算各藥劑的毒力回歸方程及相關系數(r)，并求出抑制中濃度(EC50)。

2 結果分析

2.1 田間發病情況及癥狀表現

通過田間大量的系統調查，發現“紅芯病”或“黃芯病”癥狀表現為：發病初期，植株地上莖和葉片下垂、出現急性萎蔫，但葉色仍為綠色、不脫落(圖1-B)；參根外觀正常，剖開主根，部分或整個維管束變為黃色至紅色，形成縱向的變色條帶(圖1-C)。隨著病情進一步發展，地上莖和葉片青枯，須根萎縮，主根出現軟腐，不久全株死亡，造成明顯缺苗斷壟(圖1-A)。該病發病較早，4月中下旬出現病株，5-6月份苗期為發病高峰期，發病率15%～70%。從地上顯癥到全株死亡所需時間較短，一般約6 d。根據田間發病癥狀，將該病害命名為黨參急性青枯型根腐病。

2.2 病原分離結果

采集的70份病樣中，68份(97.1%)病樣分離到真菌。共獲得68株真菌，根據培養性狀初步歸為DXDS001、DXDS002、DXDS003、DXDS004四類，DXDS002分離頻率最高(82.9%，58株)，其他3類均低于10株。

2.3 致病性測定

從每類分離物中選取1個代表菌株，用于致病性測定。結果顯示，只有接種DXDS002的植株表現出典型的急性青枯型根腐病癥狀。刺傷和無傷接種DXDS002后第2 d均顯急性青枯型根腐病癥狀，刺傷接種后第2 d全部發病，無傷接種后第4 d全部發病。再分離物與DXDS002形態學特征一致，符合柯赫氏法則，說明DXDS002為黨參急性青枯型根腐病病原菌。

2.4 病原菌形態特征

在PDA培養基平板上暗培養5 d后，DXDS002菌落圓形白色，菌落底部中心部位培養物牽牛紫色，菌絲絮狀致密(圖2)；產生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子，其中小型分生孢子為卵圓形或腎形，無隔膜或具1個隔膜，大小為(3.9～15.0) m×(1.5～4.5) m；大型分生孢子鐮刀狀，兩端尖，一般具有3～5個隔膜，大小為(18.5～35.6) m×(3.0～5.5) m。根據病原菌的形態特征，依據Booth的鐮刀菌屬分類系統[4]，病原菌DXDS002初步鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

2.5 病原菌分子鑒定

病原菌DXDS002的ITS序列與GenBank的序列進行BLAST比對后，利用MEGA6.0轉換為meg格式并采用Clustal W方法進行序列比對，建立最大似然樹(Maximum Likelihood Tree，ML樹)，發現菌株DXDS002的ITS序列與F.oxysporumCBS 140424(KT794176.1)、F.oxysporumCBS 129.24(DQ45370.14)的相似性均為100%(圖3)，結合形態學特征進一步將DXDS002鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

表1 藥劑對尖孢鐮刀菌的抑制效果

2.6 藥劑防治結果

從表1看出，25 g·L-1咯菌腈、6.25%精甲·咯菌腈、18%噻靈·咯·精甲的EC50分別為0.1355、0.2720、0.5929 mg·L-1；70%甲基硫菌靈、50%多菌靈的EC50分別為2.2783、2.2301 mg·L-1；80%乙蒜素的EC50為37.3332 mg·L-1；60.0052%噁霉靈·乙酸的EC50最高，為4 746.0990 mg·L-1。

3 結論與討論

王艷等[1]研究表明，引起甘肅地區黨參根腐病的病原菌為F.oxysporum。研究表明，引起黨參“紅芯病”或“黃芯病”的病原菌也為F.oxysporum，這和以往研究結論一致，但同一病原菌引起的主要發病癥狀不同。

本研究發現黨參“紅芯病”或“黃芯病”發病初期，植株地上莖和葉片下垂、出現急性萎蔫，但葉色仍為綠色、不脫落，參根外觀正常，剖開主根，部分或整個維管束變為黃色至紅色，形成縱向的變色條帶。隨著病情進一步發展，地上莖和葉片青枯，須根萎縮，主根出現軟腐，不久全株死亡，造成明顯缺苗斷壟；且“紅芯病”或“黃芯病”發病較早，一般4月中下旬出現病株，5-6月苗期為發病高峰期，與以往報道根腐病的發病與流行時間有所不同[1]，可能是由于根腐病的發生受土壤、氣候條件影響較大[2]。近年來，“紅芯病”或“黃芯病”發病率在15%～70%，已經成為甘肅黨參產區普遍發生的最嚴重病害。因此，本研究根據主要發病癥狀將“紅芯病”或“黃芯病”定名為急性青枯型根腐病。

化學農藥以其簡便的使用方法和良好的短期效應優勢一直是我國中藥材病害防治中最常用的方法。目前，對于黨參根腐病的防治，報道較多的農藥有多菌靈、乙酸銅，一般整地時拌土，或栽培時用甲基硫菌靈、多菌靈浸種[1,4]。本研究選用7種農藥，包括生產上常用農藥甲基硫菌靈和多菌靈，復配農藥噁霉靈·乙酸，種子處理劑咯菌腈、精甲·咯菌腈和噻靈·咯·精甲，植物源仿生殺菌劑乙蒜素，室內毒力測定表明，3種種子處理劑效果最好，好于生產上以往使用的甲基硫菌靈、多菌靈，可作為多菌靈、甲基硫菌靈的替代農藥。