低氧聯合酸脅迫富集大麥芽中γ-氨基丁酸工藝優化

周新勇 陸燕婷 尹永祺 王友根 楊正飛 方維明

(揚州大學食品科學與工程學院1，揚州 225127)

(江蘇邁康爾麥業有限公司2，鹽城 224200)

大麥在世界種植廣泛，是全球第五大農作物，其營養含量豐富，富含膳食纖維，是良好的維生素和微量元素來源[1,2]。大麥經發芽處理后，其內源酶系被激活，生理代謝反應活躍，三羧酸循環及其各支路反應活躍，γ-氨基丁酸(GABA)含量顯著提高，因此可用大麥芽開發富含GABA的功能食品[3,4]。

禾本科類植物中GABA主要通過GABA支路合成，即谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)的催化下得到GABA[5]，其后GABA會在GABA轉氨酶的催化作用下轉氨,形成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛脫氫則會生成琥珀酸，進入三羧酸循環[6-8]。

研究發現，高等植物受到外界刺激，植物體內會產生大量的GABA來應對外界逆環境的脅迫[9]。低氧脅迫是設施栽培環境中常見的一種非生物脅迫，是脅迫富集GABA最快速有效的方式之一，具有操作簡單，成本低等優勢。在低氧條件下，GABA是一種能夠調節細胞質pH來抵抗氧化性損傷的信號分子[10]。植物籽粒的氧化磷酸化作用減弱，大量的琥珀酸半醛無法轉化成琥珀酸而蓄積，抑制，GABA轉化為琥珀酸半醛的反應。采用酸性刺激也能有效積累植物體內GABA含量并增強抗感染能力，低pH值環境能夠提高GAD的活性，降低GABA轉氨酶的活性，在提高GABA的產量的同時減少其消耗，從而提高GABA含量[11,12]。

本實驗首先對浸麥階段的低氧脅迫通氧量和浸麥時間進行優化，在明確浸麥工藝的前提下，研究低氧脅迫方式、低氧脅迫通氧量、發芽緩沖液pH值和發芽時間對GABA含量的影響，并通過響應面法對其發芽條件進行優化，以期獲得大麥芽富集GABA的最佳工藝條件，為保健型大麥芽制品的開發提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲大麥Scope1，封裝于密閉容器中，4 ℃保存備用；對二甲氨基苯磺酰氯、GABA標準品、乙腈(色譜純)；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PJX-250D光照發芽箱；HC-2066高速離心機；Agilent 1260液相色譜儀；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋；KQ-250DB數控超聲波清洗器；K20干式恒溫器；BX-802發芽機。

1.3 實驗方法

1.3.1 浸麥條件優化

取150 g 大麥種子，用1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，消毒后用蒸餾水沖洗至pH中性。控制通氧量為3 L/min，6 L/min，6 L/min，分別取浸麥0、12、24、36 、48 h的樣品2.0 g，測定其含水量、露點率和GABA含量。

1.3.2 發芽條件優化

低氧發芽方式：稱量150 g種子，固定溫度為20 ℃，全程避光處理，分別采取全程低氧發芽4 d、常規條件發芽1 d后低氧發芽3d、常規條件發芽2 d后低氧發芽2 d、低氧發芽2 d后常規條件發芽2 d。常規條件發芽即為大麥置于發芽機，低氧脅迫發芽時通氧量為6 L/min，培養液為檸檬酸緩沖液(pH5.5)。取2 d和4 d樣品，測定GABA含量和芽長。

低氧發芽通氧量：稱量150 g種子，固定溫度為20 ℃，全程避光處理，正常發芽1 d后低氧浸泡發芽3 d，低氧脅迫發芽時通氧量分別為1、3、6、9 L/min，培養液為檸檬酸緩沖液(pH 5.5)。取2 d和4 d樣品，測定GABA含量。

低氧發芽培養液pH：固定通氧量為3 L/min，培養液(檸檬酸緩沖液)pH分別為3.5、4.5、5.5、6.5。取2 d和4 d樣品，測定GABA含量。

低氧發芽時間：固定通氧量為3 L/min，培養液為檸檬酸緩沖液(pH 5.5)取發芽72、84、96、108、120的樣品，測定GABA含量。

響應面實驗：在單因素實驗基礎上，根據響應面設計原理，考察通氧量、培養液pH和發芽時間對GABA含量影響，以GABA含量為響應值，采用響應曲面優化培養條件，用Design-expert 8.0.6對實驗數據進行回歸分析，得到二次線性回歸方程，找出最佳工藝參數，實驗因素水平見表1。

酶活性實驗：在上述實驗的基礎上，按優化條件發芽培養，取樣測定大麥芽相關指標。

1.4 測定指標與方法

含水量：另取100 g大麥，用同樣的工藝同時進行浸麥處理。浸麥結束后，取出樣品，拭去其表面水分，稱重后用下式計算其含水量。

含水量=

露點率：隨機選取100粒浸麥大麥樣品，記錄其露出白色根芽麥粒占總麥粒百分數；

芽長：隨機選取30粒發芽大豆，用游標卡尺測定其芽長；

GABA含量：參照Syu等[13]的方法測定；

多胺氧化酶(PAO)、氨基醛脫氫酶(AMADH)和谷氨酸脫羧酶(GAD)活性：參照Yin等[14]的方法。

2 結果與分析

2.1 浸麥工藝優化

2.1.1 浸麥條件對含水量的影響

由圖1可知，大麥含水量受到時間的顯著影響(P<0.05)，隨著浸麥時間的增加，含水量呈上升趨勢。浸麥36 h，含水量均達到37%以上。浸麥同一時間，不同通氧量間的含水量差異不顯著(P>0.05)。

注：圖中字母表示顯著檢驗結果，不同小寫字母表示處理間芽長差異達顯著水平(P<0.05)，余同。

圖1浸麥時間和通氧量對含水量的影響

2.1.2 浸麥條件對露點率的影響

由圖2可知，0～36 h大麥露點率隨時間增加顯著增加(P<0.05)，36 h的露點率達到90%，48 h達到最大值。浸麥36 h和48 h通氧量越高露點率越高。

圖2浸麥時間和通氧量對露點率的影響

2.1.3 浸麥條件對GABA含量的影響

由圖3可知，GABA含量隨時間增加而升高，48 h達到最大值。48 h時6 L/min含量最高，達到了0.132 mg/gDW。36 h時，3 L/min含量最高，達到了0.095 mg/gDW。

圖3浸麥時間和通氧量對GABA含量的影響

選擇36 h作為最佳浸麥時間。36 h時3 L/min的GABA含量最高，露點率超過90%，含水量滿足發芽準備要求的39%[15]，需要浸麥時間較短，因此控制浸麥通氧量為3 L/min，浸麥36 h。

2.2 發芽工藝優化

2.2.1 低氧脅迫方式對GABA含量及芽長的影響

由圖4可知，發芽2 d后，低氧浸泡發芽的大麥生長受到抑制，生長狀況差；發芽4 d后方式1的大麥生長狀況劣于其他發芽方式，方式4的大麥芽長生長狀態優于其他發芽方式，方式4的芽長顯著高于其余脅迫方式(P<0.05)，說明解除低氧脅迫狀態后[16,17]，大麥發芽狀況恢復正常。低氧脅迫方式對芽長的影響顯著，隨著發芽時間的增加，芽長呈上升趨勢。由圖5可知，低氧脅迫方式對樣品GABA含量影響顯著(P<0.05)，發芽4 d后方式2的GABA含量顯著高于其余脅迫方式(P<0.05)。隨著發芽時間的增加，GABA含量增加。

注：方式1：低氧發芽4 d；方式2：常規條件發芽1 d后低氧發芽3 d；方式3：常規條件發芽2 d后低氧發芽2 d；方式4：低氧發芽2 d后常規條件發芽2 d，余同。

圖4低氧脅迫方式對大麥形態和芽長的影響

圖5低氧脅迫方式對GABA含量的影響

2.2.2 通氧量對GABA含量的影響

由圖6可知，除通氧量為1 L/min外，GABA含量隨發芽時間的增加而增加，發芽4 d發芽通氧量對GABA含量影響顯著(P<0.05)，通氧量為3 L/min的GABA含量最高。

圖6發芽通氧量對的GABA含量的影響

2.2.3 培養液pH對GABA含量的影響

由圖7可知，樣品中GABA含量隨著發芽時間的增加而增加，培養液pH對GABA含量影響顯著(P<0.05)。發芽4 d在緩沖液pH2.5～4.5和4.5～6.5范圍內大麥芽中GABA含量分別隨著pH的升高先增加后減少。緩沖液pH為3.5時，GABA含量最高，達到0.250 mg/g DW。

圖7發芽緩沖液pH對GABA含量的影響

2.2.4 發芽時間對GABA含量的影響

由圖8可知，發芽時間對GABA含量影響顯著(P<0.05)，隨著發芽時間增加，GABA含量先增加后減少。發芽108 h時GABA含量最高，達到0.258mg/g DW。

圖8發芽時間對GABA含量的影響

2.2.5 響應面優化實驗2.2.5.1 響應面模型的建立與方差分析

Box-behnken實驗設計組合和數據見表2。采用Design Expert 8.0.6軟件進行二次多元回歸擬合，得GABA含量對因素A(培養液pH)、B(發芽通氧量)和C(發芽時間)的二次多項回歸擬合方程：

GABA含量=-4.682 08+1.235 41A-0.069 767B+0.047 945C+0.044 385AB-1.5106 5×10-3AC+6.593 04×10-5BC-0.155 44A2-0.011 785B2-1.868 81×10-4C2

表2 Box-Behnken實驗設計和數據表

由表3的統計分析表明，響應面模型P<0.001，說明此模型極顯著；失擬項P=0.056 2>0.05，說明此模型擬合程度較好，該模型可用于進行數據分析及統計且97.31%的數據可以用該模型解釋(R2=0.973 1)；該模型的變異系數較小CV=6.57%，說明數據的變異程度小，置信度高。表3顯示A、B、C、AB、A2、B2、C2具有顯著性，而AC、BC對響應值沒有顯著影響。在上述的因素水平范圍內，因素對響應值影響的大小順序為：A(培養液pH)>C(發芽時間)>B(發芽通氧量)。

表3 回歸模型方差分析

注：*表示在P<0.05水平上顯著，**表示在P<0.01水平上顯著。

2.2.5.2 響應曲面分析及優化

由圖9a可知，當固定培養液pH時，GABA含量隨通氧量的增加呈先增加后減少；當固定通氧量時，GABA含量隨培養液pH的增加而先增加后減少，培養液pH和通氧量之間交互作用極顯著(P<0.01)。由圖9b可知，當固定培養液pH時，GABA含量隨發芽時間的增加而先增加后減少；當固定發芽時間時，GABA含量隨培養液pH的增加而先增加后減少。由圖9c可看出，當固定通氧量時，GABA含量隨發芽時間增加而先增加后減少；當固定發芽時間時，GABA含量隨通氧量的增加而先增加后減少。

圖9 各兩因素對GABA含量的影響

2.2.6 富集工藝對GABA含量的影響

由圖10可知，不同的工藝階段對富集GABA的貢獻存在差異，低氧脅迫發芽期間的貢獻率最高，達到了71%，低氧浸麥的貢獻為26%。

圖10富集工藝對GABA含量的影響

2.2.7 酶活性實驗

圖11顯示低氧脅迫96 h內，PAO活力無顯著變化(P>0.05)，而在111 h時，其活性顯著降低，推測多胺降解途徑對大麥在低氧脅迫發芽過程中富集GABA影響有限。低氧脅迫48～96 h內AMADH活性基本保持穩定，96 h后AMADH活力顯著下降，推測本研究中AMADH活力下降原因可能與低氧環境下大麥主要依靠GABA支路合成GABA有關。GAD活性隨著低氧脅迫發芽時間的延長而降低，48 h時為GAD活力為最高值，96～111 h內，GAD活力無顯著性變化(P>0.05)。

圖11低氧聯合酸脅迫發芽期間大麥芽PAO、AMADH、GAD活力的變化

3 討論

處于休眠期的大麥籽粒通過浸麥和發芽處理，能有效解除其休眠狀態，恢復其正常的生理功能。而植物受到低氧[18]、高溫[19]、低溫[20]、鹽[21]等逆環境脅迫時，會快速啟動體內應激機制，植物體內會產生大量的GABA來應對外界逆環境的脅迫。低氧環境中，電子鏈中電子傳遞中斷，糖類經糖酵解生成大量的丙酮酸，丙酮酸分解產生乳酸和乙醇，細胞質酸度升高，H+濃度升高，刺激GAD酶活力激活[22]。張強[23]、陳惠[24]等對糙米、蠶豆等進行低氧脅迫發芽處理，成功提高了原料中的GABA含量。本研究發現，控制通氧量為4.5 L/min，最適合大麥低氧發芽富集GABA，表明一定的通氧量有利于GABA富集；而過低的通氧量可能會嚴重影響麥芽發芽期間的呼吸作用，破壞三羧酸循環、糖酵解等[25]。蔣振暉等[26]研究發現，低酸性條件有利于GAD酶的激活，酶活力會顯著提升，有利于植物體內GABA的富集。本實驗在低氧浸泡發芽的基礎上，考慮到培養液pH對結果的影響，結果證明低酸性培養液有利于低氧脅迫下發芽大麥GABA的富集。大麥是我國重要的作物，來源廣泛，可利用大麥麥芽為原料開發營養型食品以推動大麥產業特色化發展，本實驗優化所得工藝可以用于生產富含GABA的大麥麥芽，開發高GABA含量的大麥芽茶、大麥芽汁飲料、大麥面條等產品，以滿足人體對GABA的日常需求。

4 結論

本研究所得最優浸麥條件為：全程低氧浸麥，通氧量為3 L/min，浸麥36 h；低氧脅迫方式為：正常發芽1 d后低氧浸泡發芽3 d。響應面實驗顯示，發芽pH、發芽時間和發芽通氧量對于富集GABA均有顯著影響(P<0.05)；最優工藝條件：發芽pH 4.0，發芽通氧量為4.5 L/min，發芽時間111 h， GABA含量最高可達到0.335 mg/gDW，與大麥籽粒GABA含量相比，GABA含量提高了33.6倍。