茶皂素的美白功效及其抑菌和抗氧化活性研究

郭海陽 莫林蘭 譚海生 楊勁松 鄭曉燕 盛占武

(海南大學食品科學與工程學院1，海南 570228)

(海南大學材料科學與工程學院2，海南 570228)

(中國熱帶農業(yè)科學院海口實驗站3，海南 570102)

茶皂素(Tea saponin)是一種五環(huán)三萜類皂苷，又被稱作油茶皂苷，其基本結構包括具有親水性的糖體、疏水性的配基及有機酸[1]。茶皂素具有多種理化性質如乳化性、發(fā)泡性、潤滑性等，常被用作一種多功能的非離子表面活性劑。同時，茶皂素具有的多種生物活性如抗病毒、抗氧化、抗過敏、抑菌、消炎等，在食品、醫(yī)藥、農藥、日用化工以及材料加工等許多領域已被廣泛應用[2-3]。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含銅的氧化還原酶，它與生物體合成色素直接相關，也被稱為多酚氧化酶、酚氧化酶、兒茶酚氧化酶[4]。酪氨酸酶是整個黑色素生成反應的限速酶，其催化產生的黑色素被分泌并進入到表皮和毛發(fā)的角質形成細胞[5]，與色素障礙性疾病的發(fā)生和治療有關，被認為是此疾病治療藥物開發(fā)的重要靶點。紫外線引發(fā)黑色素生成，這是一種人體防御機制，黑色素可保護皮膚細胞免受有害紫外線的傷害。然而，黑色素的異常積累會導致皮膚疾病，包括里耳氏黑變病、黃褐斑和老年斑等[6]。為了減少黑色素的異常積累，人們嘗試了多種途徑，包括抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑色素從黑素細胞向角質形成細胞的轉移，以及干預黑色素生成過程中的細胞信號傳遞。盡管包括天然和合成物質在內的許多不同的化學物質在細胞基礎實驗中顯示出了有意義的抗黑素作用，但大多數化學物質在體內動物模型或人體中都產生了一些副作用，如效力不足、致癌、永久性脫色和皮炎[7-9]。近年來，研究發(fā)現越來越多的化合物如熊果苷[10]、維生素C衍生物[11]和一些中藥提取物[12]等對酪氨酸酶的活性有較為明顯的抑制效果。因此，尋找一種更為安全有效且對人體無副作用的天然來源酪氨酸酶抑制劑已成為藥學和化妝品行業(yè)的熱點研究的趨向。

本試驗擬選用油茶副產物茶皂素，通過對茶皂素抑制酪氨酸酶活性及其動力學特點和茶皂素對常見致病菌的抑菌能力、體外抗氧化活性進行研究，以期擴大油茶副產物茶皂素的開發(fā)利用，為更高的發(fā)揮茶皂素的經濟價值提供新的試驗依據，為預防和治療色素疾病以及在美白化妝品中的應用提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger) 海南大學微生物實驗室保存菌種。

茶皂素標準品、DPPH、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-17-D超凈工作臺、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、JYL-Y11高速破壁打漿機、SKP-01熱恒溫培養(yǎng)箱、MDF-382E(N)超低溫冰箱、Millipore純水儀、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋、YM50FGN全自動高壓滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素對酪氨酸酶活性抑制試驗1.3.1.1 酪氨酸酶酶提取液的制備[13]

稱取土豆，去皮于-20 ℃冷凍過夜后迅速切碎。按1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，6∶10的料液比分別加入pH=6.8磷酸緩沖液，在冰浴條件下，分別用組織搗碎機搗碎，制成10%、20%、30%、40%、50%、60%勻漿，經4層紗布過濾，取濾液在轉速4 000 r/min的離心機中離心10 min，離心后的上清液即酪氨酸酶提取液，冰浴保存，2 h內用完。

1.3.1.2 酪氨酸酶活性的測定及酶抑制率計算[14]

酪氨酸酶活力以酪氨酸酶催化L-DOPA氧化形成多巴醌的二酚酶活性來衡量。在5 mL試管，加入L-DOPA(0.015 mol/L)0.5 mL，pH=6.8磷酸緩沖液2.0 mL，30 ℃水浴保溫10 min后，再加入0.5 mL酪氨酸酶提取液，混和均勻，待酪氨酸被酪氨酸酶完全催化，將L-多巴轉化為紅色產物多巴醌，經過紫外分光光度計測量，于475 nm處有最大吸收。以每分鐘多巴色素在A475增加0.001為1個酶活力單位，即1 U/min，以每分鐘A475增加值來表示酶促反應過程的速度[15]。從混合均勻開始測量，測量到第11 min。在475 nm波長下，測定不同實驗條件下樣品的的吸光度，作圖，求直線斜率可得酶活力。根據已知酶活定義，按公式計算酪氨酸的相對酶活力及茶皂素對酪氨酸酶的抑制率。

式中：A1=A底物+酶；A2=A酶；A3=A底+酶+樣；A4=A酶+樣。

1.3.1.3 不同時間對酪氨酸酶催化 L-DOPA 氧化吸光度的影響[16]

將0.015 mol/L的L-DOPA與定量抑制劑混合均勻，在30 ℃水浴中保溫10 min，加入一定量的酪氨酸酶，分別測定不同反應時間內樣品液的吸光度及有無抑制劑存在條件下反應液的吸光度變化，并計算其抑制率。

1.3.1.4 不同L-DOPA濃度對酪氨酸酶活力的影響[17]

取定量抑制劑，分別加入0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.015 mol/L，0.02 mol/L，0.025 mol/L的 L-DOPA，混勻后30 ℃水浴10 min，水浴結束后向每支試管中加入0. 5 mL酪氨酸酶提取液，反應12 min。最后加入0. 2 mL(0. 5 mol/L)鹽酸，反應終止后立即在A475nm處進行吸光度值測定。

1.3.1.5 不同濃度茶皂素對酪氨酸酶活力的影響

按1.3.1.2方法，取0.015 mol/L底物溶液，加入不同量的抑制劑，將混合液置于試管中，30 ℃水浴加熱10 min，向每支試管中加入酪氨酸酶0.5 mL，混合均勻測定混合液在A475nm處的吸光度值，計算抑制率。

1.3.1.6 測定茶皂素對酪氨酸酶促反應動力學及抑制作用類型

茶皂素抑制酪氨酸酶二酚酶抑制動力學在3 mL測活體系中，加入定量的酪氨酸酶，改變L-DOPA的濃度，按1.3.1.2方法測定不同濃度茶皂素對酪氨酸酶活力的影響。茶皂素對酪氨酸酶的抑制類型由Lineweaver-Burk方程而得，采用雙倒數作圖法，由圖形判斷其抑制類型。茶皂素對酪氨酸酶的抑制常數Ki由不同直線的斜率分別對茶皂素質量濃度作圖求得。

1.3.2 抑菌作用試驗

1.3.2.1 菌種的活化和菌懸液的制備[18]

將-85 ℃保藏的菌株取出，置于低溫下解凍60 min，采用平板劃線法接種復活。細菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃下培養(yǎng)48 h 后，挑選出典型菌落接種于液體培養(yǎng)基中，在適宜溫度下(細菌37 ℃、真菌28 ℃)，恒溫培養(yǎng)至液體培養(yǎng)基變渾濁后，最后將渾濁液用無菌生理鹽水配制成含菌量為106～107 CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.2.2 茶皂素抑菌活性測定[19]

抑菌實驗采用牛津杯法。配制質量濃度分別為50.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的茶皂素溶液各10 mL。用移液槍吸取100 μL制備好的菌懸液，用滅菌涂布器均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，每種指示菌設3個重復。然后用鑷子夾取3個滅菌牛津杯，在培養(yǎng)基表面垂直等距放置，并使其穩(wěn)定，再在牛津杯中加入不同質量濃度的的茶皂素溶液，在第3個牛津杯中滴注無菌生理鹽水作空白對照，于冰箱中放置3～4 h，讓其充分擴散。細菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h 后，用游標卡尺測量抑菌圈，計算其平均值，并進行對比研究。

1.3.3 體外抗氧化試驗1.3.3.1 清除DPPH自由基能力[20]

將DPPH與無水甲醇混合，配制成0.01 mg/mL的DPPH甲醇溶液，配制濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的樣品溶液，用蒸餾水做空白組。分別吸取0.5 mL樣液與3 mLDPPH甲醇溶液于5 mL離心管中，震蕩均勻，在黑暗條件下靜置30 min。用紫外分光光度計測波長為517時測定樣品液的吸光度A0(若有不溶物，離心去除)，得抑制率對于濃度的趨勢曲線，并按公式計算清除率。

式中：A0為DPPH溶液的吸光度；A1為樣品與DPPH溶液混合的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

1.3.3.2 清除·OH能力的測定

根據Fenton法反應產生·OH模型[21]，由于·OH能被水楊酸捕捉而氧化生成有色物質，且該物質能在510 nm處有很強的吸收值。當有清除·OH的物質加入時，該物質會與水楊酸競爭·OH，減少有色物質的生成，從而導致吸光度降低。具體操作如下：取若干支 25 mL的比色管，按順序加入9 mmol/L FeSO4溶液1mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，不同質量濃度的茶皂素溶液2 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL，于37 ℃下反應0.5 h。蒸餾水作空白調零，測定樣品在510 nm波長下的吸光度A1，并按公式計算其清除率。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為加入樣品后的吸光度；A2為樣品溶液本身的吸光度，用蒸餾水替代顯色劑的吸光度。

1.3.3.3 總還原力的測定

總還原力的測定按文獻[22]進行，取不同濃度的茶皂素溶液和VC溶液(2、4、6、8、10 mg/mL)1 mL添加到2.5 mL(pH 6.6)的磷酸鹽緩沖液及2.5 mL 1% K3Fe (CN)6溶液中，50 ℃下保溫20 min， 冷卻后再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液混勻，3 000r/min條件下離心，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液, 靜置后于700 nm波長處測定吸光度，平行3次。

2 結果與分析

2.1 茶皂素抑制酪氨酸酶活性試驗結果

2.1.1 酪氨酸酶催化 L-DOPA氧化反應吸光度隨時間的變化

酪氨酸酶催化L-多巴反應產生紅色物質多巴醌，反應液中顏色隨產物的濃度的增加而加深。圖1為不同加酶量時吸光度隨反應時間的變化，從圖中可以看出，隨著時間的延長，反應體系的吸光度增大，即多巴醌的濃度增加，但曲線的斜率的逐漸減小，意味著反應速度降低。12 min時，曲線斜率接近零，反應不再進行，因此試驗選擇測定時間為12 min。

圖1酪氨酸酶催化L-多巴氧化反應的進程曲線

2.1.2 不同L-DOPA濃度對酪氨酸酶活力的影響

不同底物濃度對酪氨酸酶催化反應影響很大，本試驗在其他條件一定的基礎上，分別測定了不同底物濃度下對酶活力，如圖2可知，酶活力隨底物濃度的增加而升高。當底物濃度超過0.015 mol/L，酶活力基本趨于平穩(wěn)。故本試驗選擇0.015 mol/L為最佳底物反應濃度。

圖2不同底物濃度對酶活力的影響

2.1.3 不同濃度抑制劑對酪氨酸抑制率的影響

反應體系中底物質量濃度不變，加入不同量的抑制劑，補充pH=6.8磷酸緩沖液保持反應液體積為3.0 mL，測定各反應在不同時間下的吸光度變化，進而得出不同濃度的抑制劑對酪氨酸酶活性的抑制率變化見圖3。

圖3不同濃度抑制劑對酶活力影響

由圖3可知茶皂素對酪氨酸酶有抑制作用，反應時間相同時，抑制劑濃度增大，抑制率增加且隨濃度的增加對酶活性的抑制作用顯著增強，表明茶皂素對酪氨酸酶的抑制率與濃度呈線性變化關系，當茶皂素溶液質量濃度為8.0 mg/mL時，抑制率可達81.76%。

2.1.4 茶皂素對酪氨酸酶酶促反應動力學及抑制作用類型

在反應體系中，固定酪氨酸酶質量濃度，改變底物濃度，測定不同茶皂素對酪氨酸酶活力的影響，得到相應的反應速率，以底物濃度對反應速率做圖，結果如圖4所示。

圖4底物濃度對反應速率的影響

酪氨酸酶催化氧化是遵行Michealis-Menten動力學方程[23]。以底物濃度的倒數和反應速度的倒數作雙倒數圖，得到如圖5所示的對應的Lineweaver-Burk圖。

由圖5的雙倒數圖示：兩條直線相交于X軸的副軸，坐標交點(-0.42，0)。由圖5可知，未加茶皂素溶液的試驗組動力學參數Km=2.38 mg/mL，vmax= 0.014 ΔA/min，加入抑制劑的試驗組動力學參數Km=2.38 mg/mL，vmax=0.009 ΔA/min。結果顯示加入茶皂素的試驗組的Km值不變，而vmax隨抑制劑濃度增加而減小，表明茶皂素溶液對酪氨酸酶的抑制作用類型符合非競爭性抑制的特征。酪氨酸酶多亞基的含銅酶，結構復雜。酪氨酸酶在活性位點攜帶兩個銅原子，當抑制劑和底物相互競爭去結合酪氨酸酶所攜帶的銅離子時，能夠抑制酪氨酸酶活性[24]。有研究發(fā)現茶皂素能夠與銅離子絡合生成絡合物[25]，因此推測可能是由于茶皂素在酪氨酸的酶促反應過程中競爭到了銅離子而形成了絡合物，從而抑制了酶活性。

圖5抑制作用Lineweaver-Burk圖

2.2 茶皂素抑菌試驗結果

牛津杯法得到茶皂素的抑菌試驗結果見表1。由表1可以看出，茶皂素對不同微生物的抑菌效果表現均不相同，抑制效果對濃度表現出較明顯依賴性，并且抑菌圈大小隨茶皂素濃度變化呈現出隨濃度升高而增大的規(guī)律。試驗表明，茶皂素溶液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均表現出較明顯的抑制作用，對黑曲霉的抑菌效果較弱，對沙門氏菌無抑制作用。其中大腸桿菌對茶皂素最為敏感，當質量濃度為5.0 mg/mL時，就表現出一定的抑菌效果。當茶皂素質量濃度大于10.0 mg/mL時，對枯草芽孢桿菌的抑制作用增大且明顯高于大腸桿菌，當質量濃度增大至50.0 mg/mL時，枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達到23.83 mm，有較強的抑菌作用。可見茶皂素抑菌作用廣譜，為進一步開發(fā)茶皂素抑菌相關產品提供參考。

表1 不同質量濃度茶皂素抑菌作用

注：同列平均數標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 茶皂素抗氧化試驗結果

2.3.1 清除DPPH自由基能力

DPPH是一種穩(wěn)定存在的自由基，通過檢測在517 nm附近的光吸收程度可以判斷抗氧化劑對DPPH的清除能力。不同濃度的VC和茶皂素對DPPH清除率的影響如圖6所示，茶皂素對DPPH自由基有一定的清除能力。隨著茶皂素質量濃度的增加，其對DPPH自由基的清除效果增強，當茶皂素質量濃度為6 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到57.33%。

圖6清除DPPH自由基能力

2.3.2 對·OH 清除率的測定

羥基自由基(·OH)是生物活體內毒性大且最活波的自由基，圖7為不同濃度下的茶皂素和VC對羥基自由基的清除能力，從圖中可知，茶皂素對羥基自由基具有一定的清除能力。低濃度時茶皂素對·OH自由基的清除率與VC比相差較大，隨濃度的上升，樣品的清除率增大，當樣品質量濃度達到10 mg/mL時，樣品對羥基自由基的清除率達到69.89%。

圖7清除·OH自由基能力

2.3.3 茶皂素及VC的總還原力

通過測定樣品還原Fe3+能力可以反應其抗氧化能力強弱, 樣品的還原力越強其抗氧化能力就越強。圖8為700 nm處測得的吸光度值，由圖可知，吸光度值隨著茶皂素質量濃度增加而增加，其還原能力增強。通過茶皂素與VC標準品對照實驗發(fā)現，相同濃度的茶皂素與VC比還原力差異較大。

圖8茶皂素及VC的總還原力

3 結論

本研究選取油茶副產物茶皂素為研究對象，采用酪氨酸酶多巴速率氧化法測定茶皂對體外酪氨酸酶活性的抑制作用，推斷其抑制類型；利用DPPH自由基清除法、羥基自由基清除法及總還原力法對茶皂素的抗氧化能力進行研究；利用茶皂素對大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和黑曲霉(Aspergillusniger)等常見的致病菌和真菌進行抑菌實驗。結果顯示茶皂素能顯著地抑制酪氨酸酶活性，當茶皂素溶液濃度為 8.0 mg/mL 時，抑制率可達到 81.76%，茶皂素對酪氨酸酶的抑制作用類型屬于非競爭性抑制，茶皂素同時也表現出較好的抑菌抗氧化效果。本研究發(fā)現茶皂素能夠抑制酪氨酸酶活性，茶皂素不僅具有天然抗氧化成分且還具有天然抑菌成分。