響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝

楊 潔 王海麗 趙三虎 范建鳳 趙二勞

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，忻州 034000)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)又稱南美藜、藜谷等，營(yíng)養(yǎng)豐富而獨(dú)特，被譽(yù)為“營(yíng)養(yǎng)黃金”、“超級(jí)谷物”[1]。藜麥原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)[2]，我國(guó)1987年開始引種，現(xiàn)已在山西、陜西、青海和四川等地規(guī)?；N植[3,4]，資源較為豐富。藜麥中含有皂苷，且藜麥麩皮中皂苷含量更高[5,6]，藜麥皂苷具有清除自由基的抗氧化活性[7，8]。因此，研究藜麥麩皮皂苷的提取及有效提高其抗氧化活性的方法，對(duì)于藜麥麩皮皂苷的精深開發(fā)應(yīng)用具有重要的實(shí)際意義。

目前，有關(guān)藜麥皂苷的研究較多，且主要集中于提取純化工藝及其生物活性上，如黃金等[9]研究了藜麥籽粒皂苷乙醇浸提工藝；梁霞等[10]研究了藜麥總皂苷的乙醇回流提取工藝；趙亞東等[9]研究了青海藜麥中皂苷超聲輔助乙醇提取及其抗氧化活性；楊潔等[7]研究了藜麥皮皂苷的微波輔助提取及其抗氧化活性；趙文婷[11]研究了藜麥麩皮總皂苷乙醇回流提取及其抗氧化和免疫增強(qiáng)作用；而嵇麗紅等[12]則研究了不同水解方法對(duì)藜麥皂苷抑菌活性及酪氨酸酶抑制作用的影響。但有關(guān)藜麥麩皮皂苷酸水解對(duì)抗氧化活性的影響研究鮮見報(bào)道?；诖?，本研究以DPPH·清除率為指標(biāo)，鹽酸濃度、液液比、水解溫度和水解時(shí)間為因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝，并比較藜麥皂苷酸水解前后清除DPPH·能力及抗氧化活性，為藜麥皂苷用于抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮：山西華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司。以石油醚脫脂，烘箱中60 ℃烘干，粉碎過60目篩，裝瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)標(biāo)準(zhǔn)品；鹽酸、氫氧化鈉、氨水和無(wú)水乙醇等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

V-1100D型可見分光光度計(jì)； PHS-3C型智能酸度計(jì)；LWMC-201型電腦微波化學(xué)反應(yīng)器。

1.3 方法

1.3.1 藜麥皂苷提取液的制備

采用微波輔助提取藜麥麩皮中的皂苷[7]。準(zhǔn)確稱取5.0 g藜麥麩皮置于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL體積分?jǐn)?shù)68%的乙醇溶液，微波功率455 W，微波時(shí)間10 min，提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100 mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定

藜麥麩皮皂苷及其水解液對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[7,13,14]。量取1.0 mL質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL的DPPH溶液于比色管中，再加入待測(cè)液0.2 mL，用68%無(wú)水乙醇定容至5 mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min后，在最大波長(zhǎng)517 nm處測(cè)量其吸光度值為A1；測(cè)定不加待測(cè)液僅DPPH溶液吸光度為A0；測(cè)定不加DPPH溶液僅待測(cè)溶液的吸光度為A2。藜麥麩皮皂苷及其水解液對(duì)DPPH·清除率按公式計(jì)算。

1.3.3 藜麥麩皮皂苷酸水解工藝流程

藜麥麩皮皂苷提取液→加鹽酸→恒溫水解→水解液冷卻→調(diào)pH→定容→測(cè)定

主要技術(shù)參數(shù)：藜麥麩皮皂苷提取液2.5 mL，水解液水浴冷卻至室溫，氨水調(diào)水解液pH為中性，定容體積25 mL，測(cè)定體積0.2 mL，其余按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4 藜麥麩皮皂苷酸水解單因素實(shí)驗(yàn)

鹽酸濃度對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：液液比1∶3(mL/mL)，水解溫度70 ℃，分別在鹽酸濃度為1.2、2.5、4.8、6.6、8.4 mol/L條件下水解1.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對(duì)DPPH·清除率為指標(biāo)，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的鹽酸濃度。

液液比對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：水解溫度70 ℃，鹽酸濃度4.8 mol/L，分別在液液比為1∶1.8、1∶2.4、1∶3、1∶3.6、1∶4.2(mL/mL)的條件下水解1.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對(duì)DPPH·清除率為指標(biāo)，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的液液比。

水解溫度對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：液液比為1∶3(mL/mL)，鹽酸濃度4.8 mol/L，分別在水解溫度為50、60、70、80、90 ℃的條件下水解1.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對(duì)DPPH·清除率為指標(biāo)，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的水解溫度。

水解時(shí)間對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：在液液比1∶3(mL/mL)，水解溫度70 ℃，鹽酸濃度4.8 mol/L的條件下，分別水解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對(duì)DPPH·清除率為指標(biāo)，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的水解時(shí)間。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以鹽酸濃度(A)、液液比(B)、水解溫度(C)、水解時(shí)間(D)為自變量，藜麥皂苷水解液對(duì)DPPH·清除率為響應(yīng)值(Y)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，由模型分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳水解工藝條件。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.6 藜麥麩皮皂苷酸水解產(chǎn)物推測(cè)

采用薄層色譜法進(jìn)行藜麥麩皮皂苷酸水解產(chǎn)物推測(cè)[15，16]。實(shí)驗(yàn)所用的正相展開劑為三氯甲烷∶甲醇=6∶1，反相展開劑為甲醇∶水=2.7∶1，顯色劑為濃硫酸∶無(wú)水乙醇=1∶9。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

指標(biāo)數(shù)據(jù)均為3次平行測(cè)定值，作圖采用Origin 8.0軟件，數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行，P<0.01為差異極顯著；P<0.05為差異顯著；P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1 皂苷酸水解單因素實(shí)驗(yàn)

各因素對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解影響結(jié)果見圖1。隨著水解鹽酸濃度的增加，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率先增后減，當(dāng)鹽酸濃度為6.6 mol/L時(shí)，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率最高，為50.43%。當(dāng)鹽酸濃度低于6.6 mol/L時(shí)，增加鹽酸濃度有利于皂苷糖鏈的斷裂，產(chǎn)生系列相應(yīng)的次級(jí)皂苷或者皂苷元，使水解液清除DPPH·的能力升高；當(dāng)鹽酸濃度大于6.6 mol/L后，可能由于溶液中氯離子濃度偏高，使水解成的部分皂苷元轉(zhuǎn)化為羥基氯代物，導(dǎo)致水解液清除DPPH·的活性降低[17]。因此選擇鹽酸濃度為6.6 mol/L為最適工藝條件。

隨著液液比的增加，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率先增大后減小。當(dāng)液液比小于1∶2.4(mL/mL)時(shí)，隨著液液比中鹽酸量的增加，從而使皂苷酸水解程度增加，皂苷水解液清除DPPH·能力增強(qiáng)；當(dāng)液液比為1∶2.4(mL/mL)時(shí)，皂苷水解液DPPH·清除率最大。當(dāng)液液比大于1∶2.4(mL/mL)，皂苷水解液清除DPPH·能力降低，其原因可能是水解液中存在的蛋白、淀粉等雜質(zhì)影響水解進(jìn)行[17,18]，抑制了皂苷水解，導(dǎo)致皂苷水解液清除DPPH·能力減弱。因此，選擇液液比1∶2.4(mL/mL)為最適工藝條件。

隨著水解溫度的升高，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率先增后減，在水解溫度為80 ℃時(shí)，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到最大，為57.0%。當(dāng)水解溫度小于80 ℃時(shí)，隨水解溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，單位體積內(nèi)皂苷分子與鹽酸分子相互碰撞的機(jī)會(huì)增多，促進(jìn)了皂苷水解反應(yīng)的發(fā)生，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率增大；當(dāng)水解溫度大于80 ℃時(shí)，可能由于溫度過高，水解產(chǎn)物中皂苷元等發(fā)生轉(zhuǎn)化，減少皂苷元類物質(zhì)的生成[18]，導(dǎo)致水解液對(duì)DPPH·的清除率降低，因此選擇水解溫度80 ℃為最適工藝條件。

水解初期反應(yīng)進(jìn)行較快，隨著水解時(shí)間增加，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率逐漸增加，當(dāng)水解時(shí)間為2.0 h時(shí)，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到最大，為59.83%。當(dāng)水解時(shí)間大于2.0 h后，再延長(zhǎng)水解時(shí)間，皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率降低。其原因可能是水解初期，隨時(shí)間增加，皂苷與鹽酸分子接觸時(shí)間增長(zhǎng)，使得水解逐漸趨于完全，水解液中皂苷元等增加，水解液對(duì)DPPH·的清除率增加；當(dāng)水解時(shí)間大于2.0 h后，可能由于水解時(shí)間過長(zhǎng)，產(chǎn)生的皂苷元部分發(fā)生脫水、環(huán)合、雙鍵移位、取代基移位、構(gòu)型轉(zhuǎn)化等結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[19]，使得皂苷水解液對(duì)DPPH·的清除率降低。因此選擇水解時(shí)間2.0 h為最適工藝條件。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，以水解液對(duì)DPPH·的清除率為響應(yīng)值(Y)，鹽酸濃度(A)、液液比(B)、水解溫度(C)和水解時(shí)間(D)為因素，按Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型及方差分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2響應(yīng)面

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合和方差分析。擬合的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：Y=0.64+0.01A+3.450×10-0.03B+0.016C+0.035D-0.011AB-0.019AC-0.047AD+6.875×10-0.03BC-0.020BD-0.019CD-6.708×10-0.03A2-6.008×10-0.03B2-0.052C2-0.015D2，從回歸方程系數(shù)可以看出，各因素對(duì)響應(yīng)值影響的大小順序?yàn)椋篋(水解時(shí)間)>C(水解溫度)>A(鹽酸濃度)>B(液液比)。對(duì)回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

由表3方差分析可知，實(shí)驗(yàn)擬合的二次多項(xiàng)回歸模型具有高度的顯著性(P<0.000 1)，模型失擬項(xiàng)P=0.430 2>0.05，不顯著，說明建模成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用該模型描述。模型的決定系數(shù)R2=0.974 7，說明響應(yīng)值的變化有97.47%來(lái)源于所選因素，該模型與實(shí)際情況接近，實(shí)驗(yàn)擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能充分反映各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。變異系數(shù)CV=1.6%<5%，說明模型的置信度較高，重現(xiàn)性較好，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。因此可以用該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表3還可看出，鹽酸濃度、水解溫度和水解時(shí)間的一次項(xiàng)，水解溫度和水解時(shí)間的二次項(xiàng)，以及鹽酸濃度與水解溫度、鹽酸濃度與水解時(shí)間、液液比與水解時(shí)間、水解溫度與水解時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響都達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，鹽酸濃度與液液比的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，說明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響較為復(fù)雜，不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而應(yīng)是拋物面關(guān)系。由表3中各因素F值的大小可知，各因素對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解物清除DPPH·能力影響的大小順序?yàn)椋核鈺r(shí)間> 水解溫度> 鹽酸濃度> 液液比，這與利用模型方程系數(shù)分析的結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析

注：*差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01。

2.2.3 因素間交互作用分析

根據(jù)回歸方程得出不同因子交互作用的響應(yīng)面分析圖以及等值線圖如圖2～圖7所示。

觀察各因素間交互作用的響應(yīng)面圖形，若響應(yīng)曲面坡度越彎曲，則響應(yīng)值對(duì)于因素的改變?cè)矫舾校喾辞嬖狡骄彛瑒t響應(yīng)值對(duì)于因素的改變?cè)竭t鈍[20]；等高線圖的形狀可反映交互作用的強(qiáng)弱，等高線圖形越橢圓，表示交互作用越顯著[21]。從圖2～圖7可以直觀地看出，AC、AD、BD、CD即鹽酸濃度與水解溫度、鹽酸濃度與水解時(shí)間、液液比與水解時(shí)間、水解溫度與水解時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，這與模型的方差分析結(jié)果一致。

圖2 鹽酸濃度與液液比交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

圖3 鹽酸濃度與水解溫度交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

圖4 鹽酸濃度與水解時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

圖5 液液比與水解溫度交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

2.2.4 最佳工藝條件與驗(yàn)證

根據(jù)擬合模型方程得到藜麥麩皮皂苷酸水解的最優(yōu)條件為：鹽酸濃度4.85 mol/L，液液比1∶1.91(mL/mL)，水解溫度為80.52 ℃，水解時(shí)間為2.49 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的具體情況，各參數(shù)調(diào)整為：鹽酸濃度

圖6 液液比與水解時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

圖7 水解溫度與水解時(shí)間相互影響的響應(yīng)面圖與等高線圖

4.8 mol/L，液液比1∶2(mL/mL)，水解溫度80 ℃，水解時(shí)間2.5 h。在此工藝條件下，進(jìn)行5次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取其平均值，得到藜麥麩皮皂苷水解物對(duì)DPPH·的清除率為68.84%，由回歸方程計(jì)算得藜麥麩皮皂苷水解物對(duì)DPPH·的理論清除率為69.14%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.43%，表明結(jié)果可靠，驗(yàn)證了擬合模型的可行性。

2.3 DPPH·清除率比較

在藜麥麩皮皂苷相同濃度下，比較酸水解前后皂苷液對(duì)DPPH·的清除率，5次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得水解前皂苷液對(duì)DPPH·的清除率平均為22.8%，水解后皂苷液對(duì)DPPH·清除率平均為68.8%，顯著檢驗(yàn)表明，水解前后皂苷液對(duì)DPPH·清除率存在極顯著差異(P<0.01)，藜麥麩皮皂苷經(jīng)酸水解后其清除DPPH·的能力及抗氧化活性極顯著提高。酸水解可有效提高藜麥麩皮皂苷清除自由基及抗氧化活性。

2.4 藜麥皂苷酸水解產(chǎn)物推測(cè)

對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜分析，結(jié)果如圖8所示。藜麥麩皮皂苷水解后產(chǎn)物在正相薄層色譜板(圖8a中A)上方、反相薄層色譜板(圖8b中A)下方，表明水解產(chǎn)物極性相對(duì)水解前皂苷極性更小。另外，比較圖8中A與C可發(fā)現(xiàn)，藜麥麩皮皂苷經(jīng)過酸水解后，產(chǎn)物的極性介于苷元(齊墩果酸)和2個(gè)雙糖及2個(gè)三糖基皂苷之間。表明經(jīng)酸水解后，藜麥麩皮皂苷可能生成了極性較小的單糖苷或者其他苷元。推測(cè)這些極性更小的次級(jí)皂苷以及皂苷元清除DPPH·的能力即抗氧化能力強(qiáng)于藜麥皂苷，導(dǎo)致藜麥麩皮皂苷酸水解后抗氧化活性增強(qiáng)。

注：A：皂苷酸水解后；B：皂苷酸水解前；C：5種皂苷類單體(齊墩果酸、3-O[-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤苷元]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖美商陸酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[β-D- glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖美商陸酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[β-D-glucopyranosyl- (1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤苷元]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。

圖8薄層色譜圖

3 結(jié)論

以DPPH·清除率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鹽酸濃度、液液比、水解溫度和水解時(shí)間為因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了藜麥麩皮皂苷酸水解工藝。結(jié)果表明，影響藜麥麩皮皂苷酸水解的因素大小順序?yàn)椋核鈺r(shí)間> 水解溫度> 鹽酸濃度> 液液比，優(yōu)化的藜麥麩皮皂苷酸水解最佳工藝條件：鹽酸濃度4.8 mol/L，液液比1∶2(mL/mL)，水解溫度80 ℃，水解時(shí)間2.5 h。在該工藝條件下，藜麥麩皮皂苷酸水解物對(duì)DPPH·清除率顯著高于酸水解DPPH·清除率。表明酸水解可有效提高藜麥麩皮皂苷清除自由基抗氧化活性。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)藜麥麩皮皂苷酸水解后可有效提高清除DPPH·能力進(jìn)行了研究，而有關(guān)藜麥麩皮皂苷酸水解產(chǎn)物為何種皂苷元，以及何種皂苷元起到清除自由基的抗氧化作用還有待深入研究。