一株球孢白僵菌的分離鑒定及其對草地貪夜蛾的致病性

雷妍圓，章玉蘋*，薛志洪，王裕華，黃少華，呂利華

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣州 510640；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda是聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)預(yù)警的跨國界遷飛性害蟲，已在美洲、非洲及亞洲等近100個國家迅速擴散，對當(dāng)?shù)赜衩住⑺尽⒏收帷⒏吡弧⒚藁ā⒒ㄉ⒋蠖沟茸魑镌斐闪司薮髶p失(Casmuzeetal., 2010; Earlyetal., 2018; 姜玉英等，2019；張磊等，2019)。自2019年1月以來，該蟲從境外遷入我國西南、華南地區(qū)，短短數(shù)月迅速向北蔓延，至目前發(fā)生區(qū)域已涉及全國近20多個省份，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅(廖永林等，2019；王磊等，2019；楊普云等，2019)。

目前草地貪夜蛾防控主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但該蟲對農(nóng)藥具有較強抗性(Yuetal., 2003; Ríos-Díez & Saldamando-Benjumea, 2011; Carvalhoetal., 2013; 李永平等，2019)，化學(xué)防治易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，對人、畜和非靶標(biāo)生物造成傷害。植保工作者在其物理、生物防治方面做了很多工作，到目前為止，仍未有一種生防病原真菌能對草地貪夜蛾起到完全的控制效果。然而，昆蟲病原真菌以其寄主范圍廣、擴散力強、易于商品化生產(chǎn)和可持續(xù)性控制蟲害等優(yōu)勢在對草地貪夜蛾的防治中具有重要的應(yīng)用前景(Shah & Pell, 2003; 張禮生和陳紅印，2014；Rivero-Borjaetal., 2018; 陳萬斌等，2019；張維等，2019)。由于草地貪夜蛾入侵我國時間較短，對其微生物防治研究起步較晚，篩選對草地貪夜蛾高特異性和高效率的病原真菌，大力推動微生物殺蟲劑的研究與利用，是我國草地貪夜蛾可持續(xù)防控工作的重要任務(wù)。

在昆蟲病原真菌防控草地貪夜蛾方面，國內(nèi)外報道球孢白僵菌Beauveriabassiana、金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae和萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi對草地貪夜蛾卵和低齡幼蟲有一定的防治效果(Lezama Gutiérrezetal., 1996, 2001; Carneiroetal., 2008; Garcíaetal., 2011; Thomazonietal., 2014; Akutseetal., 2019; 鄭亞強等，2019)。玫煙色蟲草Cordycepsfumosorosea[原玫煙色棒束孢Isariafumosorosea(Kepleretal., 2017)]可致病幼蟲各齡期，對低齡防效最佳(Lezama Gutiérrezetal., 2001; 雷妍圓等，2020)。從已報道的菌株來看，大部分僅對草地貪夜蛾卵和低齡幼蟲防效較好，對3齡以上高齡幼蟲及其他蟲態(tài)的防效普遍較差。白僵菌Beauveriaspp.是100多屬昆蟲病原真菌中最常見和最重要的屬之一，在我國現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的所有白僵菌種之中，球孢白僵菌作為一種廣譜性微生物殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)害蟲防治中具有重要地位(Hajek & St. Leger, 1994)。我國利用球孢白僵菌在馬尾松毛蟲和玉米螟防治中的應(yīng)用也成為了世界上最大規(guī)模的真菌殺蟲劑應(yīng)用項目(李增智，2015)。本研究室從廣州地區(qū)野外采集的感菌稻黑蝽上分離純化獲得1株病原真菌，對其進行了形態(tài)學(xué)鑒定和ITS-rDNA序列分析，通過致病性測定，確定其最佳殺蟲活性的孢子懸浮液濃度，以期為尋求對草地貪夜蛾更加持續(xù)且高效的生物防治方法提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和菌株分離培養(yǎng)

草地貪夜蛾幼蟲采集于廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地“粵甜28”甜玉米ZeamaysL.植株上，在實驗室用玉米葉和果穗飼養(yǎng)至化蛹，待其羽化產(chǎn)卵后建立實驗室種群作為供試蟲源。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為26±1℃，相對濕度60%～90%，光照條件14 L ∶10 D。

昆蟲病原真菌采自廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)濕地狐尾藻上罹病稻黑蝽Scotinopharalurida若蟲僵蟲(圖2 A)，將帶菌蟲體置于滅菌培養(yǎng)皿(d=9 cm)，在超凈工作臺中用接種針輕輕挑起少量孢子，采用劃線法接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L)，于28±1℃，全黑暗，相對濕度70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，挑取少量孢子至新的培養(yǎng)基純化培養(yǎng)15 d，平板上長出的菌落形態(tài)特征一致，將該菌編號為GZSL-1。將純化的菌株分生孢子置于20%甘油，并保存于-80℃冰箱中。

1.2 菌株培養(yǎng)形態(tài)觀察

分離純化的菌株GZSL-1接種于PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L)，于28±1℃，全黑暗，相對濕度70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。采用光學(xué)顯微鏡(Axio Scope A1，Zeiss)和掃描電鏡(S-3400N，Hitachi)觀察菌落形態(tài)特征、菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)等顯微結(jié)構(gòu)。

1.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

以菌株GZSL-1基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行菌株rDNA-ITS序列PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中上下游引物各1.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株rDNA-ITS測序結(jié)果進行編輯，去除序列兩端質(zhì)量不好的堿基，將優(yōu)化好的ITS序列提交到NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通過BLAST程序進行比對，得到與目的菌株具有同源性的多個菌株相應(yīng)序列，從中下載同源性較高的序列，使用MEGA 7.0軟件，通過鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)，運行1 000 次 bootstrap驗證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Kumaretal., 2004)。

1.5 菌株對草地貪夜蛾幼蟲侵染癥狀觀察

從SDAY平板上收集菌株GZSL-1分生孢子，以滅菌0.05%吐溫-80溶液配制1×108孢子/mL濃度孢子懸浮液，分別接種草地貪夜蛾1～6齡幼蟲，接種后每天觀察幼蟲存活情況及感染病蟲的外部特征，將死亡幼蟲保濕培養(yǎng)，蟲體表面長出白色菌絲或分生孢子的視為感菌致死。

1.6 菌株對草地貪夜蛾幼蟲的致病力測定

采用浸蟲法處理草地貪夜蛾幼蟲，以滅菌0.05%吐溫-80溶液配制1×104、1×105、1×106、1×107、和1×108孢子/mL共5個濃度梯度的孢子懸浮液，每個濃度為一個處理，以滅菌0.05%吐溫-80溶液處理為對照。選取個體大小一致的1～6齡幼蟲，放入供試孢子濃度的懸浮液中，浸漬10 s后挑出，置于濾紙上吸去多余水分，移至皿底墊有濕潤濾紙片的培養(yǎng)皿(d=7.5 cm)中。為避免高齡幼蟲自相殘殺，1～2齡幼蟲高密度集體飼養(yǎng)(10頭/皿)，3齡幼蟲低密度集體飼養(yǎng)(5頭/皿)，4～6齡幼蟲單頭飼養(yǎng)(1頭/皿)，皿內(nèi)放入充足的新鮮玉米葉供其取食(王道通等，2019)。處理后的幼蟲置于人工氣候箱中飼養(yǎng)(26±1℃，RH 80%±5%，14 L ∶10 D)。每個處理20～30頭幼蟲，重復(fù)3次，持續(xù)觀察6 d，每天記錄幼蟲死亡數(shù)，對死亡幼蟲進行保濕觀察，確定是否為感菌致死。

1.7 數(shù)據(jù)處理

累計死亡率(%)=(處理死亡總蟲數(shù)/處理總蟲數(shù))×100

累計校正死亡率(%)=(處理累計死亡率-對照累計死亡率)/(1-對照累計死亡率)×100

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，使用SPSS 20.0軟件進行處理分析，統(tǒng)計各處理幼蟲的累計死亡率和累計校正死亡率。采用Probit方法計算致死中時(LT50)，求回歸方程及計算致死中濃度(LC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

對分離純化培養(yǎng)的菌株形態(tài)特征進行鑒定，觀察菌株平板正面菌落培養(yǎng)初期呈乳白色，后略變?yōu)榈滁S色，孢子層厚且均勻，菌落邊緣孢子較少，菌落生長速度快，在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d時，菌落直徑達到24.5 mm，菌落中心至邊緣1/2處凸起同心環(huán)(圖2 B)。菌落背面黃色，無深褐色環(huán)(圖2 C)。營養(yǎng)菌絲無色，分生孢子梗著生于營養(yǎng)菌絲，分生孢子在菌絲或泡囊上簇生，著生在產(chǎn)孢細胞延伸而成的“之”字形結(jié)構(gòu)上；分生孢子透明、光滑，球形或近球形，直徑2.0～2.3 μm(圖2 D)。

使用PCR擴增目的菌株的rDNA-ITS序列片段，測序結(jié)果顯示擴增片段為498 bp，將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)目的菌株的ITS序列與已報道的多個球孢白僵菌菌株對應(yīng)序列的相似性均達到99%及以上。選取相關(guān)序列，使用MEGA 7.0將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對得到的序列下載構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。本目的菌株與B.bassianaTNS/DWD/BB05(MK346250.1)處于進化樹最小分支，親緣關(guān)系最近，同源性最高。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為球孢白僵菌，編號GZSL-1菌株。

圖1 基于ITS基因序列構(gòu)建目的菌株與其他球孢白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)Fig.1 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and other related Beauveria bassiana strains based on ITS region sequence (Neighbour-Joining method)注：括號內(nèi)為菌株在GenBank中的登錄號；各分枝上的數(shù)字表示支持率。Note: The numbers in parentheses represent GenBank accession numbers. The numbers in each branch points denote the percentages supported by bootstrap.

2.2 感染球孢白僵菌GZSL-1的草地貪夜蛾幼蟲癥狀

草地貪夜蛾各齡幼蟲皆可被菌株GZSL-1感染(圖2 E-J)。在感菌初期，幼蟲取食行為、蟲體外部形態(tài)與健康幼蟲無差別。接種2 d后，低齡幼蟲(1～3齡)幼蟲取食明顯減少或停止取食，部分幼蟲死亡。接種后第4天，各齡期幼蟲皆出現(xiàn)球孢白僵菌感染致死個體。感菌的低齡幼蟲體表覆蓋菌絲和分生孢子，分生孢子呈白色。高齡幼蟲(4～6齡)感菌死亡時間相對低齡較晚，體表被白色菌絲包裹。

圖2 菌株GZSL-1培養(yǎng)特征和草地貪夜蛾幼蟲感染癥狀Fig.2 Morphological characteristics of strain GZSL-1 on PDA plate and external symptoms of larvae of Spodoptera frugiperda after infection treatment注：A，野外被球孢白僵菌侵染的稻黑蝽若蟲僵蟲；B，菌落正面；C，菌落背面；D，分生孢子和菌絲體；E，1齡幼蟲；F，2齡幼蟲；G，3齡幼蟲；H，4齡幼蟲；I，5齡幼蟲；J，6齡幼蟲。Note: A, symptoms of infected Scotinophara lurida nymphs in field; B, colony on the positive; C, colony on the back; D, conidia and mycelium; E, 1st instar larva; F, 2nd instar larva; G, 3rd instar larva; H, 4th instar larva; I, 5th instar larva; J, 6th instar larva.

2.3 球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲的致病力測定

用5個濃度球孢白僵菌GZSL-1孢子懸浮液處理草地貪夜蛾1～6齡幼蟲，隨著孢子濃度增加和時間推移，幼蟲累計死亡率逐漸升高(圖3)。以1×104孢子/mL濃度處理，6 d后1～6齡幼蟲的累計校正死亡率分別為76.47%、65.12%、48.24%、36.78%、13.48%和5.75%。隨著濃度的升高，菌株對各齡幼蟲的致死率逐漸升高。當(dāng)孢子濃度為1×108孢子/mL時，1至3齡幼蟲的累計校正死亡率均達100%，4齡和5齡幼蟲也分別達57.47%和55.06%，6齡僅25.28%。

圖3 球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲的致病力Fig.3 The pathogenicity of Beauveria bassiana strain GZSL-1 against Spodoptera frugiperda larvae注：A，1齡；B，2齡；C，3齡；D，4齡；E，5齡；F，6齡。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

應(yīng)用Probit模型，計算球孢白僵菌GZSL-1處理的草地貪夜蛾1～5齡幼蟲LC50值(表1)，其分別為1.32×103、3.42×103、1.01×104、1.61×105和1.23×107孢子/mL。結(jié)果表明致中死濃度，1齡和2齡幼蟲最低，均為103孢子/mL，3～4齡為104和105孢子/mL，對5齡幼蟲的LC50最高，107孢子/mL。草地貪夜蛾1～4齡幼蟲對該菌株較敏感，其次5齡，6齡幼蟲敏感性最低。

2.4 球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲的致死時間效應(yīng)

隨球孢白僵菌GZSL-1孢子懸浮液濃度的增加，草地貪夜蛾幼蟲的致死中時(LT50)縮短(表2)。孢子濃度越高，幼蟲的LT50值越小，在1.0×104～1.0×108孢子/mL范圍內(nèi)，1齡幼蟲LT50從3.58 d降至1.69 d，對2齡幼蟲的LT50從4.30 d降至1.78 d，對3齡幼蟲的LT50從5.70 d降至3.12 d；在濃度為1.0×105～1.0×108孢子/mL的范圍內(nèi)，對4齡幼蟲的LT50從5.45 d降至4.85 d；在濃度為1.0×107～1.0×108孢子/mL的范圍內(nèi)，對5齡幼蟲的LT50從5.04 d降至5.02 d。當(dāng)孢子濃度為1.0×104孢子/mL時，4齡幼蟲最終死亡率為38.89%，低于50%；當(dāng)濃度為1.0×104和1.0×106孢子/mL時，5齡的最終死亡率從14.45%升至37.71%，6齡的最終死亡率從8.89%升至15.56%，均低于50%；濃度為1.0×107～1.0×108孢子/mL時，6齡幼蟲的最終死亡率從21.11%升至27.80%，亦低于50%，因此無法計算LT50值。

表1 球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲的致病力回歸方程

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“-”表示草地貪夜蛾幼蟲的最終死亡率低于50%，無法估算LC50。Note: Data in a column are presented as mean±SD. “-” represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LC50values cannot be estimated.

表2 球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲的致死中時間

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“-”表示草地貪夜蛾幼蟲的最終死亡率低于50%，無法估算LT50。Note: Data in a column are presented as mean±SD. “-”represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LT50values cannot be estimated.

3 結(jié)論與討論

我國微生物資源豐富，發(fā)展生物農(nóng)藥具有充分的優(yōu)勢。為進一步豐富草地貪夜蛾生物防治菌種資源，本研究從采集的感菌稻黑蝽若蟲分離獲得1株對草地貪夜蛾有高致病性的昆蟲病原真菌GZSL-1，根據(jù)該菌株培養(yǎng)形態(tài)特征及ITS序列比對分析，將其鑒定為球孢白僵菌。菌株GZSL-1對草地貪夜蛾1齡至6齡幼蟲皆有侵染效果，但齡期間的致病力差異較大。在同一孢子濃度下，對低齡幼蟲的致病力大于高齡幼蟲，對高齡幼蟲的LC50遠大于低齡幼蟲的LC50，即使以高濃度孢子懸浮液侵染，對6齡幼蟲的致死率僅25.28%(1.0×108孢子/mL)，這與以往報道的草地貪夜蛾病原真菌相類似，絕大部分僅對草地貪夜蛾低齡幼蟲防效較好(Lezama Gutiérrezetal., 2001; Carneiroetal., 2008; Garcíaetal., 2011; Thomazonietal., 2014; Akutseetal., 2019; 鄭亞強等，2019；雷妍圓等，2020)。盡管菌株GZSL-1對4齡和5齡幼蟲具有一定程度的致病力，但也僅為50%的致死率，因此利用球孢白僵菌GZSL-1防治草地貪夜蛾幼蟲的適期是低齡幼蟲種群的高峰期。

篩選昆蟲病原真菌高效菌株時，致病力是衡量其防效潛力的重要指標(biāo)之一。目標(biāo)害蟲死亡率越高且LT50越短，意味著菌株具有更好的致病力。據(jù)報道，用35株球孢白僵菌B.bassiana菌株和14株金龜子綠僵菌M.anisopliae對草地貪夜蛾進行致病力篩選，僅有1株球孢白僵菌菌株Unioeste 26可導(dǎo)致草地貪夜蛾3齡幼蟲44.5%死亡率(Thomazonietal., 2014)。對分離自非洲的6個球孢白僵菌和14個綠僵菌的殺蟲效果進行分析，在1.0×108孢子/mL的孢子濃度下，大部分的綠僵菌菌株對卵、初孵幼蟲和2齡幼蟲有高于80%的致病力，但僅有一株球孢白僵菌ICIPE 676對2齡幼蟲造成30%的死亡率(Akutseetal., 2019)。此外，另有報道1株球孢白僵菌菌株Bb42對草地貪夜蛾2齡幼蟲的LC50為5.92×103孢子/mL，且1.0×109孢子/mL時，其2齡幼蟲死亡率達96.6%，致死中時LT50為3.6 d(Garcíaetal., 2011)。本研究表明，對于齡期相同的2齡幼蟲，供試球孢白僵菌GZSL-1的LC50為3.42×103孢子/mL，略低于前者的5.92×103孢子/mL；當(dāng)處理孢子懸浮液濃度低于前者，僅為1.0×108孢子/mL時，1～3齡幼蟲的累計死亡率皆達100%，較Bb42的致病力強；再以2齡幼蟲LT50值比較，當(dāng)孢子濃度為1.0×108孢子/mL時，本研究僅1.78 d，較前者的致死速度快。表明本研究中供試球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲具有較高的致死率和較短的致死中時，菌株具有較強的致病力，有進一步研究的價值。

球孢白僵菌作為一種重要的昆蟲病原真菌，其制劑的應(yīng)用開發(fā)潛力巨大，但球孢白僵菌菌株具異核現(xiàn)象，從蟲尸上分離的野生型菌株多為異核體，由于異核體穩(wěn)定，人工培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)過程中，異核內(nèi)核比例不斷變化，更適應(yīng)于培養(yǎng)基腐生類型的核被選擇出來占優(yōu)勢，這意味著分離出來的菌株在腐生條件下存在變異和退化可能。從菌株分離、毒力保持到利用白僵菌菌劑在自然環(huán)境中進行大規(guī)模害蟲防治，仍然面臨著諸多問題。雖然本研究中的球孢白僵菌GZSL-1對草地貪夜蛾幼蟲具有較強致病力，這說明在室內(nèi)條件合適時可起如此大的作用，但在田間應(yīng)用時是否有同樣的致病力，以及如何挖掘菌株本身的潛力去適應(yīng)外界條件，還有許多工作要做。