桑根酮D對腫瘤細胞及移植瘤生長作用研究

王 藝，魏 華，楊 光，張 梅

石河子大學藥學院 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆石河子 832000

癌癥，又稱惡性腫瘤，是嚴重危害人類健康、導致現(xiàn)代人類死亡的第一大惡疾和頑癥。近20年，我國的惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，目前國內(nèi)多數(shù)腫瘤患者，以中晚期居多，治愈率較低。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢。雖然對細胞癌變機制的認識在不斷深入，然而人們在控制癌癥的征途中步履維艱，進展緩慢，人類將面臨著防治惡性腫瘤的新挑戰(zhàn)[1]。惡性腫瘤的治療方法早期多以手術(shù)為主，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，失去了手術(shù)切除的機會。放療等其他方法療效均不理想，且副作用大。所以，臨床上藥物治療仍為多數(shù)病人不可缺少的治療手段。因此，尋找新的抗癌藥物并探討其分子機制是目前癌癥防治措施的研究重點。

桑樹中有抗癌作用的黃酮類化合物，其特有的Diels-Alder型加合物，以桑根酮D(sanggenon D)含量較高。藥理學研究證實該單體具有明顯的降壓、抗炎作用，但其抗癌作用研究鮮有報道。目前，國外僅證明這種化合物對PKC、ODC和COX-1等癌癥相關(guān)因子有抑制作用，國內(nèi)主要研究該單體的提取工藝[2-5]。本課題前期的實驗結(jié)果顯示，桑根酮C(是桑根酮D的同分異構(gòu)體)能抑制多種人腫瘤細胞，尤其對肝癌細胞最為敏感[6]。本研究開展了桑根酮D體內(nèi)外抗癌活性的研究，旨在探究桑樹中抗癌活性成分，發(fā)現(xiàn)更好的抗癌藥物，為藥用植物黑桑的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo 3131)，超凈工作臺(ZHJH-1112B)，蔡司熒光倒置顯微鏡(MIC00266)，酶標儀(Thermo 3001)，普通生物倒置顯微鏡(BDS200-PH)，電子天平(AR-2140 型)，MH-2微量振蕩器，HH.S精密恒溫水浴鍋，離心機(TGL 16 M)，超聲波清洗器，電熱恒溫鼓風干燥箱，超低溫冰箱，4 ℃冰箱等。

1.2 樣品與試劑

桑根酮D(英文名稱：sanggenon D；純度：HPLC>98%；CAS號：81422-93-7；分子量：708.70；分子式：C40H36O12；產(chǎn)品貨號：HS052274，購于寶雞市辰光生物科技有限公司)，5-氟尿嘧啶(美侖生物)，1640(HyClone)，PBS，0.4%SRB溶液，胰蛋白酶(BOSTRE)，小鼠黑色素瘤B16F0細胞、小鼠黑色素瘤B16F10細胞、人肝癌HepG2細胞(中科院上海細胞庫)，小鼠肝癌細胞H22細胞株(北京協(xié)和細胞資源庫)，昆明種(KM)小鼠(石河子大學實驗動物中心)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

用含10%血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞、小鼠黑色素瘤B16F0細胞、B16F10細胞。

1.3.2 細胞增殖測定

將對數(shù)生長期的B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞分別按照2×104、3×104、8×104個/mL濃度接種于96孔板(180 μL/孔)，24 h后，加入不同濃度的桑根酮D和5-FU處理細胞，48 h后采用SRB法檢測細胞增殖情況。

1.3.3 黑色素含量的測定

按照Vandana法，將對數(shù)生長期的B16F0、B16F10細胞以1.0×105個/孔鋪于6孔板中，加入三個濃度的桑根酮D(20、40、80 μmol/L)，24h后，PBS洗2次，用0.25%的胰酶消化收集于離心管，再次用PBS洗一次并倒入離心管，3 500 rpm離心5 min，收集上清液，取1 mL上清液加入1 mL 0.4 M HEPES buffer(pH 6.8)和1 mL乙醚∶乙醇=1∶1(V∶V)，取下層水相，于405 nm測定細胞外吸光度(A)；取細胞沉淀，細胞計數(shù)后加入含10%DMSO-NaOH 1.5 mL于80 ℃煮1 h，3 500 rpm離心10 min，取上清液，于405 nm測定細胞內(nèi)吸光度(A)。

1.3.4 細胞克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的B16F0、HEPG2、B16F10單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，將B16F0、HEPG2細胞懸浮在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中備用，B16F10懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。將細胞以每孔100個/mL的濃度接種于6孔板中，24 h后加入不同濃度的桑根酮D(5、10、20、40、80 μmol/L)，置37 ℃、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)7天。在蔡司熒光倒置顯微鏡下觀察集落形成情況并拍照。終止培養(yǎng)棄去上清，用PBS潤洗2次，用甲醇固定10 min后，棄固定液用Giemsa應用染色液染10 min后，用PBS沖洗多余染液，空氣干燥。拍照并計算肉眼可見的集落數(shù)，最后計算克隆形成率。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞按5×108/L的密度接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的桑根酮D，培養(yǎng)24 h。離心收集細胞1×105～5×105。加入300 μL Binding buffer，再加入5 μL FITC標記的Annexin V，室溫混勻并避光30 min，然后加入PI，避光反應5 min。上流式細胞儀進行檢測。

1.3.6 對小鼠肝癌細胞移植動物腫瘤生長的影響

取KM鼠，制備H22小鼠肝癌單細胞懸液，每只小鼠腋窩皮下接種2×106個/mL的細胞懸液(0.2 mL/只)。在接種后第一天開始給藥，將動物隨機分5組，為模型組、5-FU組(20 mg/kg)、桑根酮D低(12.5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量組，連續(xù)腹腔注射桑根酮D 10天。末次給藥后24h，處死動物，剝離瘤組織并稱重，通過計算得抑瘤率。考察桑根酮D對肝癌移植瘤的抑制作用。

1.3.7 對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

1.3.6 項中，剝離瘤組織后，取小鼠心、肝、腎、脾等臟器并稱重，通過計算得臟器指數(shù)。考察桑根酮D對荷瘤小鼠各臟器的毒性。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 桑根酮D對B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞增殖抑制作用

SRB檢測結(jié)果顯示(圖1A、B、C)，5、10、20、40、80 μmol/L的桑根酮D和5-FU分別作用于B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞48h后，細胞增殖均被抑制，且隨著桑根酮D和5-FU濃度升高，增殖抑制作用增強。與空白組比較，均有顯著性差異(P<0.01)。計算得桑根酮D對B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞的IC50分別為26.71±0.2 μmol/L、40.46±0.03 μmol/L、22.61±0.26 μmol/L。此結(jié)果表明桑根酮D對HepG2細胞增殖抑制作用最強。

圖1 桑根酮D抑制細胞增殖

2.2 桑根酮D促進細胞黑色素生成

處理細胞24 h后，不同濃度的桑根酮D均可使B16F0、B16F10細胞外(圖2A、2C)與細胞內(nèi)(圖2B、2D)黑色素生成增加(P<0.01)。生成的黑色素越多，表明細胞的分化程度越高。胞內(nèi)和胞外的黑色素含量與對照組相比均升高，且成劑量依賴性，可見10、20、40 μmol/L的桑根酮D可以使B16F0、B16F10細胞分化，惡化程度降低。

2.3 桑根酮D抑制細胞克隆

桑根酮D處理B16F0、B16F10細胞后，細胞集落數(shù)減少，抑制其生長。從圖3A可以看出并計數(shù)，B16F0細胞對照組的集落數(shù)為71個，5、10、20、40 μmol/L的SD組形成的集落數(shù)為43、33、17、15個。從圖3B可以看出，B16F10細胞對照組的集落數(shù)為88個，5、10、20、40 μmol/L SD組形成的集落數(shù)為70、62、45、7個。同樣，桑根酮D處理的HepG2細胞實驗結(jié)果見圖3C，對照組集落數(shù)64個，而5、10、20、40 μmol/LSD組形成集落數(shù)為53、51、29、13個，其形成的集落的個數(shù)均少于對照組的克隆數(shù)，增殖能力下降，集落形成能力也減弱，說明較高濃度的桑根酮D抑制HepG2生長。

2.4 桑根酮D對HepG2細胞形態(tài)的影響

正常組HepG2腫瘤細胞形態(tài)規(guī)則，大小均勻，細胞核清楚可見，且均呈貼壁生長狀態(tài)，少有懸浮細胞存在。其他SD各組細胞形態(tài)不規(guī)則，體積變小，細胞間隙增加，貼壁細胞減少，部分細胞脫落懸浮在培養(yǎng)液中，結(jié)果見圖4。

2.5 桑根酮D誘導HepG2細胞凋亡

桑根酮D對細胞凋亡的影響(圖5a、b、c、d)。5、10、20 μmol/L的桑根酮D處理HepG2細胞24 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率分別為：7.12%±0.98%、8.09%±1.4 %、11.07%±1.17%(圖5e)。與陰性對照組比較，三個濃度的桑根酮D誘導細胞凋亡作用具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 桑根酮D對黑色素瘤細胞中黑色素生成的影響

圖3 桑根酮D對細胞克隆的影響

圖4 不同濃度的SD對HepG2細胞形態(tài)的影響

圖5 桑根酮D對HepG2 細胞凋亡的影響

2.6 桑根酮D抑制移植瘤生長

建立小鼠H22腫瘤模型，分為模型組、桑根酮D低劑量組(SD-L，12.5 mg/kg)、桑根酮D中劑量組(SD-M，25 mg/kg)、桑根酮D高劑量組(SD-H，50 mg/kg)和5-氟尿嘧啶陽性組(5-FU，20 mg/kg)，除模型組外其余組腹腔注射給藥。桑根酮D對小鼠的體重影響不大(圖6)，與空白對照組相比無顯著性差異，說明桑根酮D對小鼠的生長無明顯影響。高中低三個劑量組的桑根酮D均具有抑制腫瘤生長作用(圖7和圖8)，且在該劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(表1)。桑根酮D對小鼠H22腫瘤的抑制率為32.51%～45.72%。

表1 桑根酮D對小鼠H22腫瘤的抑制作用及其對荷瘤小鼠生長的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with control,*P< 0.05;**P<0.01.

圖6 桑根酮D對荷瘤小鼠生長的影響

2.7 桑根酮D對小鼠臟器的毒性研究

肝臟指數(shù)結(jié)果顯示(圖9)，桑根酮D組均小于陽性對照組和模型組，與空白組相近。對于腎臟指數(shù)，與模型組比較，中、高劑量桑根酮D具有顯著性差異(P<0.05)。桑根酮D對心臟的影響(圖10)，與模型組比較，中、高劑量桑根酮D組具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與正常組比較，心臟指數(shù)變化不大。脾臟指數(shù)變化結(jié)果(圖10)，高、中、低三個劑量的脾臟指數(shù)比正常組大，但比模型組小(P<0.05)。毒理學中，臟器指數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等，臟器指數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[5]。由此可見，桑根酮D對小鼠肝臟、脾臟、心臟、腎臟毒性小。

圖7 H22異種移植腫瘤組織

圖8 桑根酮D對小鼠H22腫瘤的抑制作用

圖9 桑根酮D對小鼠肝臟、腎臟的臟器指數(shù)的影響

3 討論

惡性腫瘤嚴重威脅著人類健康和生命，已成為人類死亡的第一殺手。肝癌是我國高發(fā)腫瘤，且死亡率高、救治率低。雖然治療手段多，但化療藥物是必不可少的。目前臨床采用的化療藥物帶來的不良反應重、多，而且容易耐藥，導致預后效果差。這些現(xiàn)狀迫使尋找新的高效低毒的抗癌藥物成為防治癌癥的重點。

圖10 桑根酮D對小鼠心臟、脾的臟器指數(shù)的影響

桑白皮(Cortex Mori)是桑科桑屬植物MorusalbaL.的干燥根皮。為中國藥典收載的常用中藥之一，具有瀉肺平喘、利水消腫功效。現(xiàn)代藥理研究表明，桑白皮降糖降脂主要藥效成分為桑白皮黃酮、生物堿及多糖類成分[9]，而桑根酮D和桑根酮C是桑樹中特有的黃酮結(jié)構(gòu)，在桑黃酮中含量高[6-8]。桑白皮具有抗癌、抗炎、降血壓、降血糖、和抗動脈粥樣硬化等藥理作用，臨床可用于治療前列腺癌、“三高”等疾病[10-13]。機制研究發(fā)現(xiàn)桑白皮的甲醇提取物可抑制 NF-κB 而誘導人宮頸癌細胞的凋亡，而且可以靶向殺滅腫瘤干細胞[14,15]。

本研究發(fā)現(xiàn)桑根酮D抑制B16F0細胞、B16F10細胞、HepG2細胞增殖，桑根酮D對人肝癌HepG2細胞最為敏感。通過用肝癌細胞動物模型來考察SD體內(nèi)抗癌作用，發(fā)現(xiàn)桑根酮D具有抑制移植瘤生長的作用。這些結(jié)果顯示，桑根酮D具有體內(nèi)外抗肝癌的作用。而桑根酮D 對小鼠臟器指數(shù)的影響比模型組的要小，也比陽性對照組5-FU對各臟器指數(shù)小。表明桑根酮D對小鼠脾臟、心臟、腎臟毒性小。本研究說明桑根酮D作為抗癌候選化合物，具有毒性小的優(yōu)勢。

此外，桑根酮D促進B16F0細胞黑色素生成，生成的黑色素越多，表明B16F0細胞的分化程度越高，說明桑根酮D能使細胞分化，惡性程度降低，細胞往好的方向發(fā)展。結(jié)合對黑色素瘤細胞的胞內(nèi)胞外黑色素含量的測定，黑色素含量是黑色素瘤分化能力的重要標志[16]，藥物誘導黑色素瘤細胞分化為較成熟的上皮樣細胞的同時，黑色素的生成能力也增加，生成的黑色素越多，表明細胞的分化程度越高[17]，由于B16F0和B16F10細胞分化，其惡性程度降低，細胞會由低分化向成熟細胞分化。有效的誘導分化劑可使細胞的黑色素含量增加2倍以上[18-20]，提示桑根酮D有誘導B16F0和B16F10細胞向正常黑色素樣細胞分化的能力。但本研究結(jié)果顯示，桑根酮D具有誘導細胞分化成正常細胞的能力。本研究還發(fā)現(xiàn)桑根酮D具有誘導肝癌細胞凋亡的作用。

本實驗只是初步探討了桑根酮D可誘導細胞分化和誘導細胞凋亡，具體通過的信號轉(zhuǎn)導通路還不清楚，需進一步研究，桑根酮D是否可作為一種有效的輔助手段用于肝癌患者的治療，還有待更深入的研究。