苦參堿對小鼠S180肉瘤細胞凋亡及對FAS/FASL信號途徑的影響

黃光弦，趙 蕊，盧 相，王淑美

重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016

當前癌癥發病率、死亡率呈持續增長趨勢，癌癥問題迫在眉睫，但目前并無有效方法徹底根治。中藥抗腫瘤效果明顯，副作小且治療后存活率高，因此逐漸成為研究熱點。其中，中藥苦參堿的抗腫瘤研究較多，其抗腫瘤作用明顯，不良反應少，其制劑和復方已應用于臨床試驗。苦參為豆科植物苦參的干燥根，味苦，性寒，具有強心、抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種藥理活性[1,2]。苦參堿(matrine，MT)是從傳統中醫苦參中提取的生物堿，在體外對多種腫瘤細胞如胰腺癌[1]、肺癌[2]、結腸癌[3]、乳腺癌[4]和前列腺癌[5]具有殺傷作用。Fas/FasL是近年來研究得最為深入的有關細胞凋亡的膜表面分子信號通路，是細胞凋亡最關鍵的信號機制，能和死亡受體結合激活胞內凋亡信號分子，發出信號并傳遞至細胞內，調節基因轉錄，從而誘導細胞凋亡[6]。本研究探討了苦參堿對小鼠S180肉瘤細胞凋亡及其對Fas/FasL信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

SPF級昆明小鼠(北京維通利華有限公司)；苦參堿(中國藥品生物制品檢定所，批號110805-201709，20 mg/支，純度>99%)；TUNEL染色試劑盒(美國Sigma公司)；FAS、FASL、Caspase-8和β-actin抗體(美國Abcam公司)；Caspase-8檢測試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；SDS-聚丙烯酰胺、PBST溶液、垂直電泳儀及GIS-2020D凝膠圖像分析系統(Sigma公司)。

1.2 S180肉瘤小鼠肉瘤模型的建立

從液氮罐中取出S180細胞株，37 ℃水浴中使之迅速解凍移到離心管內，加入10 mL RPMI1640培養液，振搖混勻，2000 rpm離心2次(5 min/次)，除去凍存液，用10 mL RPMI1640培養液稀釋10倍，振搖成混懸液，在超凈工作臺上進行小鼠腹腔注射1 mL傳代。取傳代第8天的S180腹水小鼠，脫頸椎處死，無菌抽取腹水，以生理鹽水調至瘤細胞濃度為3.2×107個/mL混懸液。接種取昆明種小鼠33只雌雄各半，用1 mL的一次性注射器吸取S180腫瘤細胞懸液0.2 mL，右前肢腋窩部皮下注射。接種24 h后，剔除死亡小鼠1只及狀態不佳小鼠2只，將剩余30只小鼠分為5組，每組6只，對照組、苦參堿10 mg/kg、苦參堿25 mg/kg、苦參堿50 mg/kg和順鉑組(DDP 5 mg/kg)，對照組采用生理鹽水灌胃，苦參堿組采用不同濃度苦參堿灌胃，順鉑組采用順鉑5 mg/kg腹腔注射3天，正常飼養，每3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑(L)和短徑(W)，計算腫瘤體積：TV=(L×W2)/2，繪制成腫瘤增長曲線。飼養12天后取出瘤體，統一處死各組小鼠，剝離肉瘤，并測定的瘤體重量。計算抑瘤率=[(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重]×100%。

1.3 肉瘤組織TUNEL法檢測凋亡

每組隨機選取部分腫瘤組織標本，經包埋劑OCT混合物包埋后冰凍，用冷凍切片機制作4 μm 冰凍切片，嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書要求步驟進行操作。光學顯微鏡下觀察3組切片內細胞凋亡情況，以細胞內有棕黃色物質或整個細胞呈棕黃色判定為凋亡細胞，每張切片計數5個隨機視野(×400)，每個視野計數400個細胞，計算腫瘤凋亡率，腫瘤凋亡率(apoptosis rate)=(凋亡細胞總數/腫瘤細胞總數)×100%。

1.4 肉瘤組織Caspase-8活性測定

每組隨機取部分腫瘤組織標本，用PBS洗滌3次，加入組織裂解緩沖液，冰浴條件下剪碎組織，用勻漿器勻漿至充分裂解，在4 ℃條件下10 000 rpm離心10 min，吸取上清液，-20 ℃保存。采用二喹啉甲酸(BCA)比色法進行蛋白定量。按Caspase-8活性活性檢測試劑盒說明加入緩沖液及底物，加入100 μg總蛋白。37 ℃孵育60 min，405 nm檢測吸光度。做標準曲線同時測定并計算caspase-8活性。

1.5 免疫組化檢測FAS/FASL蛋白表達

每組隨機取部分腫瘤組織標本，石蠟包埋切片，脫蠟，梯度乙醇脫水，過氧化氫浸泡15 min，TritonX-100通透15 min，羊血清37 ℃濕盒封閉25 min，滴加一抗4 ℃孵育過夜。次日二抗室溫孵育2 h，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液室溫2 h，DAB顯色，封片，顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot方法檢測小鼠肉瘤的FAS/FASL蛋白及Caspase-8的表達影響

每組隨機取部分腫瘤組織標本，組織勻漿后，進行BCA蛋白定量檢測，取等量蛋白樣品進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，一抗稀釋于0.5%BSA液中，與印跡膜室溫孵育2 h，取出用TBST洗膜10 min×3 次，然后用0.5%BSA液稀釋的二抗與印跡膜于室溫孵育2 h后，TBST液洗膜15 min×3次，ECL試劑發光，凝膠成像儀觀察成像，進行統計學分析。

1.7 統計分析

實驗數據用Mean±SD表示，采用SPSS17.0軟件進行檢驗，正態分布資料統計描述采用均數±標準差，服從正態分布采用方差分析進行多組間比較，繼而采用t檢驗進行組內比較，采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學差異，P<0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 苦參堿對小鼠肉瘤成瘤實驗的影響

小鼠肉瘤模型建立成功，實驗結束時，對照組、苦參堿10、25、50 mg/kg與順鉑5 mg/kg五組肉瘤的平均腫瘤重量為4.6±1.7、3.1±1.2、1.9±0.8、1.5±0.6和2.8±1.6 g。苦參堿三組的腫瘤重量和抑瘤率與對照組相比，差異具有顯著統計學差異(P<0.01)。隨著苦參堿濃度增加，抑瘤率也不斷增加，具有明顯濃度依賴性。苦參堿25和50 mg/kg組的腫瘤重量和抑瘤率明顯低于順鉑組，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)(見圖1)。

圖1 苦參堿對S180肉瘤小鼠腫瘤生長情況及抑瘤率的影響

2.2 TUNEL染色觀察苦參堿對肉瘤凋亡情況的影響

TUNEL染色中棕褐色即為凋亡陽性細胞。對照組凋亡細胞數量少見，凋亡率2.7%±0.8%；苦參堿10、25、50 mg/kg組凋亡細胞顯著增加，分別為32.8%±4.9%、39.6%±7.2%和46.7%±9.4%，與正常對照相比具有顯著統計學差異(P<0.01),且與苦參堿濃度呈現正相關趨勢。順鉑組凋亡率為37.8%±8.4%，苦參堿25和50 mg/kg組凋亡率高于順鉑組，具有顯著統計學差異(P<0.01)(見圖2)。

2.3 Caspase-8活性測定

與對照組相比，苦參堿10、25和50 mg/kg的Caspase-8活性逐漸增加，差異均具有顯著統計學意義(P<0.01)，且Caspase-8活性隨著苦參堿濃度增加而增加，具有明顯濃度依賴性。苦參堿25和50 mg/kg組Caspase-8活性高于順鉑組，具有顯著統計學差異(P<0.01)(見圖3)。

圖2 苦參堿對肉瘤小鼠瘤體細胞凋亡情況的影響

圖3 苦參堿對肉瘤小鼠瘤體Caspase-8活性的影響

2.4 免疫組化觀察苦參堿對肉瘤小鼠瘤體FAS/FASL表達的影響

免疫組化觀察肉瘤組織中FAS染色及FASL染色呈現棕黃色，對照組FAS染色及FASL染色較為淡染，而低、中、高濃度苦參堿組FAS染色及FASL染色與對照組相比明顯增強，差異具有統計學意義(P<0.05)，其中以高濃度苦參堿組增加最為顯著，具備濃度依賴性(見圖4及圖5)。

圖4 免疫組化觀察苦參堿對肉瘤小鼠瘤體FAS表達的影響

圖5 免疫組化觀察苦參堿對肉瘤小鼠瘤體FASL表達的影響

2.5 苦參堿對肉瘤小鼠瘤體FAS/FASL及Caspase-8蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，低、中、高濃度苦參堿FAS、FASL及Caspase-8表達較對照組明顯增加，差異具有顯著統計學意義(P<0.05)，且FAS、FASL及Caspase-8表達與苦參堿濃度呈現正相關趨勢(見圖6)。

圖6 Western Blot觀察苦參堿對肉瘤小鼠瘤體FAS/FASL及Caspase-8表達的影響

3 討論

苦參為豆科植物苦參的干燥根，味苦，性寒，始見于《神農本草經》，主心腹氣結，癥瘕積聚，黃疸，溺有余瀝等，其中癥瘕積聚描述的是腹部腫塊，苦參具備明目、養肝膽、清熱解毒、殺蟲、祛風濕、瀉血解熱痢的功效，臨床上苦參注射液多用于肝炎及腸道疾病的治療[7,8]。

苦參堿是從傳統中醫苦參中提取的生物堿，是苦參的主要有效成分。多項研究發現苦參堿具有抗腫瘤的效果：Li等[9]發現苦參堿能夠通過下調ERK-NF-kappa B進而抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲轉移。苦參堿通過降低細胞周期蛋白mRNA的表達，在G0/G1期阻斷細胞周期，顯著抑制橫紋肌肉瘤細胞的增殖[10]。Zou等[11]發現苦參堿抑制人骨肉瘤MG-63細胞增殖和誘導凋亡，苦參堿具有提高肉瘤小鼠生存質量、抑制肉瘤小鼠腫瘤細胞生長等作用，其作用機制亦涉及多個方面，主要表現在促進腫瘤細胞凋亡，降低瘤細胞的增殖，提高機體抗腫瘤能力，以及降低瘤組織的侵襲轉移能力等[12]。有研究認為[13]，苦參堿對肺癌腫瘤血管形成有明顯的抑制作用。苦參堿亦能協同增強肺癌化療的效果，降低化療的骨髓抑制，減輕化療的毒副反應[7,8]。本研究發現苦參堿和順鉑能顯著抑制肉瘤小鼠腫瘤生長，并且增加肉瘤小鼠腫瘤組織的凋亡率，且苦參堿25 mg/kg和50 mg/kg抑制腫瘤生長和促腫瘤凋亡的效果甚至優于順鉑5 mg/kg，說明苦參堿能夠促進肉瘤細胞凋亡，與其他研究結果較為一致[12]。

死亡受體介導信號通路是新近發現的一種細胞凋亡途徑，死亡受體FAS屬腫瘤壞死因子受體超家族，死亡受體FAS與配體 FASL結合形成Fas結合蛋白(FADD)，結合死亡效應結構域及Caspase-8前體，形成Fas-FADD-Caspase-8前體組成的死亡誘導復合物(DISC)，激活Caspase-8，活化后的Caspase-8可以進一步激活執行死亡功能的效應蛋白Caspase3、6、7等，觸發一系列級聯反應，最終導致細胞死亡[14,15]。研究顯示[16]，苦參堿在體內外均能通過上調Fas/FasL，激活Caspase-3、8和9誘導骨肉瘤細胞凋亡。苦參堿能夠以劑量依賴的方式誘導胰腺癌凋亡，這一作用與降低Bcl-2/Bax的比例，上調Fas，促進Caspase-3、8和9的活化有關[17]。苦參堿通過上調Fas/FasL和活化Caspase-3亦能誘導胃癌細胞凋亡[15]。苦參堿能夠促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，其作用機制可能是上調Fas蛋白的表達、抑制端粒酶活性和抑制腫瘤血管的形成有關[18]。苦參堿能夠通過活化Caspase-3、8和9促進鼻咽癌細胞凋亡[19]。上述研究說明苦參堿能夠調控部分腫瘤細胞FAS/FASL表達，活化Caspase-8，并且這些作用與促進腫瘤細胞凋亡高度相關[15-19]；但目前少見苦參堿與肉瘤細胞FAS/FASL信號通路相關報道。本研究結果顯示，苦參堿和陽性對照順鉑均能夠上調肉瘤小鼠腫瘤組織中的FAS/FASL表達，增加Caspase-8活性和表達，且苦參堿的這些作用呈現濃度依賴性，說明苦參堿可能能夠通過上調FAS/FASL信號途徑，活化Caspase-8，進而抑制肉瘤組織生長及促進肉瘤細胞凋亡。

綜上所述，苦參堿能夠促進肉瘤小鼠腫瘤組織的凋亡，并且該作用與上調FAS/FASL表達及活化Caspase-8有關。