花牛蘋果幼果多酚單體酚降血壓成分的篩選

高義霞 呼麗萍 袁毅君

摘要：為了充分利用農業廢棄物蘋果疏果，以花牛蘋果疏果為材料，通過微波輔助提取蘋果多酚，利用大孔樹脂NKA-9對提取的粗多酚進行分離，再通過Sephadex LH-20進一步純化分離精制，得到5種單體酚，分別為綠原酸、表兒茶素、根皮苷類、兒茶素、槲皮素;利用分光光度法測定各單體酚對血管緊張素酶的抑制效果。結果表明，槲皮素、根皮苷、兒茶素、表兒茶素具有明顯的抑制ACE的作用，與陽性藥物相比較，槲皮素和根皮苷的效果明顯優于卡托普利，表兒茶素和兒茶素的效果與卡托普利相當。

關鍵詞：蘋果多酚;降血壓;ACE酶抑制;綠原酸;表兒茶素;根皮苷;兒茶素;槲皮素

中圖分類號： R284 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0232-04

收稿日期：2019-04-28

基金項目：甘肅省自然科學基金（編號：1610RJZE141）。

作者簡介：高義霞（1982—），女，甘肅白銀人，碩士，副教授，主要從事資源植物的開發利用研究。E-mail：egaoxy@126.com。

我國是世界蘋果產業規模最大的國家，2014年我國蘋果栽培面積和年產量分別達到 226.67萬hm2 和 3 800萬t，疏果量達285萬t[1];以甘肅省為例，蘋果栽培面積和年產量分別達到 32萬hm2 和320萬t，疏果量約為24萬t。而幼果中的多酚含量為成熟果實的10倍，約占幼果的 1%～2%，是蘋果多酚豐富的來源，開發價值很高[2]。據專家預測，多酚的需求量將會以每年40%的速度增長。目前，茶多酚制品已形成相當的市場規模，相關研究發現，蘋果多酚的許多生理功能比茶多酚要高100倍以上[3]，因此，開發蘋果多酚制品具有廣闊的銷售市場。目前，絕大多數的蘋果疏落果被丟棄，極少量以沼氣或者飼喂家禽等方式消化，既污染了自然環境，也產生大量的農業垃圾，造成極大的資源浪費[4]。相關報道表明，蘋果多酚混合物具有抑制血管緊張素轉化酶（ACE）的活性，具體作用機制不清楚。高血壓是威脅人類健康的“頭號殺手”，2010年，我國高血壓患者達2億人，且每年以1千萬人的速度增長，因此，如何有效預防高血壓成為人們共同面對的挑戰[5]。Tom等研究發現，血壓升高與ACE活性有著密切的聯系，抑制ACE活性可降壓[6]，如人工合成的降壓藥卡托普利正是利用這一治療機制，但副作用明顯，因此，人們試圖尋找天然的ACE抑制劑來開發天然降壓藥或具有降壓保健功能的藥食重組產品。目前，國內關于茶多酚對ACE活性的降壓機制研究較為成熟，但關于蘋果多酚抑制ACE活性的研究卻鮮有報道。本研究將蘋果多酚中單體酚作為指標成分，建立一種快速、簡便、靈敏、準確、重復性好的檢驗方法，旨在為蘋果多酚降血壓活性指標的質量控制和血管緊張素抑制劑的藥物研制提供試驗依據。對蘋果多酚的開發和利用不僅可以減少大量廢棄蘋果幼果資源浪費，而且可以變廢為寶，減少環境污染，構建和諧文明社會，具有深遠的現實意義和社會意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花牛蘋果疏除幼果，采自甘肅省天水市麥積區中灘鎮九龍山蘋果基地，采集時間為2016年6月5日，處理前保存于0 ℃冷庫中。福林酚試劑（Folin-Ciocalteu），上海潤順化工有限公司;沒食子酸標準品（≥99%），阿拉丁試劑;果膠酶（>500 AJDU/mg），Sigma公司;異抗壞血酸，湖南世紀華星生物工程有限公司;無水乙醇，國產分析純。

KQ-500型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司;紫外-可見分光光度計（UV-2450），日本島津生產;九陽料理機（JYL-C022），九陽集團;TGL-20M 型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀公司生產。

1.2 蘋果多酚的提取

取花牛蘋果幼果，切塊后，按10 g ∶ 1 mL的比例（蘋果樣品：異抗壞血酸）加入10%異抗壞血酸水溶液作為護色劑，破碎后，精確稱取樣品10.000 g，加入1.7 mg果膠酶于50 ℃酶解2 h，按照料液比 1 g ∶ 10 mL 加入50%（體積分數，下同）乙醇，380 W 下微波提取2 min，提取次數2次，提取液抽濾，收集濾液，定容備用[7]。

1.3 標準曲線的制作及多酚含量的測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[8]。取0.1 g沒食子酸標準品，用100 mL 50 %乙醇溶液溶解，搖勻后，分別取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 標準液，加入3 mL稀釋3倍的Folin-Ciocalteu試劑，搖勻，反應2 min后加入2 mL 7.5 %碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，30 ℃保溫30 min，740 nm處測定D值。標準曲線方程：y=0.088 7x+0.005 5，r2=0.9 993，式中：x為吸光度，y為沒食子酸質量濃度（μg/mL）。蘋果多酚含量的測定按同法操作。計算多酚含量的公式：多酚得率=C×V×N/m×100%，式中：C為測量液總酚質量濃度（μg/mL）;V為粗提液體積（mL）;N為稀釋倍數;m為樣品質量（g）。

1.4 蘋果多酚的純化

采用大孔樹脂柱NKA-9，以丙酮為溶劑，柱層析初步分離蘋果粗多酚。根據其對蘋果多酚動態吸附、解吸附柱層析試驗，每5 mL收集1次，氮吹濃縮后，通過理化性質進行鑒別。利用Sephadex LH-20進一步純化分離精制，得到分離物質，與標準品對比，經高效液相色譜（HPLC）比對確定為5種單體酚[9-11]。

1.5 單體酚降血壓活性研究

以對ACE的抑制能力為靶標，以降壓藥物卡托普利（ACE抑制劑）為陽性對照，體外研究蘋果多酚各單體的降血壓活性，篩選出活性明顯的成分。基本方法為在模擬人體生理條件下，利用ACE催化水解馬尿酰組氨酰亮氨酸生成馬尿酸，當加入ACE抑制劑時，催化水解反應被抑制，生成的馬尿酸含量減少。馬尿酸在存在喹啉的條件下與苯磺酰氯反應生成黃色化合物，在乙醇溶液中最大吸收波長為470 nm，故可比色定量，根據馬尿酸吸收值的大小來衡量ACE的抑制活性[12]。

2 結果與分析

2.1 蘋果多酚的分離鑒定

利用大孔樹脂柱NKA-9，分離得到4組成分，分別為FA、FB、FC、FD。組分FA通過Sephadex LH-20 分離（重復操作2次），分離洗脫曲線見圖1-a，得到1個組分FA1（480.2 mg）。組分FC通過Sephadex LH-20分離（重復操作4次），分離洗脫曲線見圖1-b。通過大孔樹脂及Sephadex LH-20 分離（重復操作3次），最終得到4個組分FC1（182.0 mg）、FC2（273.6 mg）、FC3（123.6 mg）、FC4（1 079.0 mg）。由于組分FB、FD均為分離到的非有效的酚類物質，故棄去。

圖2、圖3為經過Sephadex LH-20進一步分離純化所得到的高純度產物色譜，圖3為同等色譜條件下5種標準品混合溶液的HPLC結果。將圖2與圖3相對照，可知經大孔樹脂初步分離，所得到的高純度單一產物FA1可能是綠原酸，FC1可能是表兒茶素，FC2可能是根皮苷類，FC3可能是兒茶素，FC4可能是槲皮素。

2.2 蘋果單體酚對ACE的抑制作用

以上述步驟分離的5種單體酚為研究對象，利用其對ACE的抑制作用，模擬人體生理條件，測定各單體酚對ACE的抑制作用，以其評價其降血壓活性。

2.2.1 馬尿酸標準曲線 參照文獻[13]的測定方法，稱取適量馬尿酸標準品，分別配成含量為0.00、002、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16 mg/mL的馬尿酸水溶液，向各管中加入0.6 mL喹啉，混勻后再加入0.2 mL苯磺酰氯，立即蓋緊比色管塞，手動強烈振蕩25～30次，在（30±2） ℃條件下避光放置30 min。加入3.7 mL 95%（體積分數）乙醇，混勻，繼續避光放置30 min。用10 mm比色杯取中間濃度管掃描，確定最大吸收波長為470 nm，以試劑空白（0號管）為參比，在470 nm處測量各管的吸光度。最后以吸光度為縱坐標、馬尿酸含量為橫坐標，繪制馬尿酸含量與混合溶液吸光度的標準曲線，詳見圖4。

2.2.2 卡托普利對ACE抑制作用 為了確立ACE的活性測定體系，進行不同濃度卡托普利對ACE抑制活性的測定。從圖5可以看出，隨卡托普利質量濃度不斷增大，其對ACE的抑制作用不斷增強，當卡托普利質量濃度增至100 μg/mL時，卡托普利對ACE的抑制作用不再明顯增加，說明其趨于飽和，利用SPSS 16.0計算得出卡托普利對ACE的IC50為67.49 μg/mL。

2.2.3 不同抑制劑對ACE活性的抑制效果 根據上述方法，對每一種試劑在不同濃度下進行測定，研究不同濃度下各成分對兔肺ACE活性的影響，結果見圖6。計算得綠原酸、根皮苷、兒茶素、槲皮素、表兒茶素IC50分別為138.43、38.23、68.28、28.33、62.09 μg/mL，表明槲皮素、根皮苷、兒茶素、表兒茶素具有明顯的抑制ACE的作用，與陽性藥物相比較，槲皮素和根皮苷的效果明顯優于卡托普利，表兒茶素和兒茶素的效果與卡托普利相當。

3 結論

以花牛蘋果疏果為材料，通過微波輔助提取蘋果多酚，利用大孔樹脂NKA-9對提取的粗多酚進行分離，再通過Sephadex LH-20進一步純化分離精制，得到5種單體酚，分別為綠原酸、表兒茶素、根皮苷類、兒茶素、槲皮素。利用分光光度法測定各單體酚對血管緊張素酶的抑制效果，結果表明，槲皮素、根皮苷、兒茶素、表兒茶素具有明顯的抑制ACE的作用，與陽性藥物相比較，槲皮素和根皮苷的效果明顯優于卡托普利，表兒茶素和兒茶素的效果與卡托普利相當。

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