基于Nrf2/Keap1/ARE通路研究槲皮素對小鼠年齡相關性黃斑變性的保護作用

陳婷妍，周 洋

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是老年人失明最常見的原因，全球患病率為8%[1]。近三分之一的早期ARMD發展為新生血管性ARMD(nARMD)。衰老、遺傳、飲食、吸煙、肥胖和血管疾病都與ARMD的發病機制有關[2]。轉錄因子NF-E2相關因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是一種關鍵轉錄因子，已被確定能夠激活抗氧化反應[3]。正常生理情況下，Nrf2與Keap1蛋白存在于細胞質中，處于相對穩定狀態。當受到氧化應激因子等刺激后，Nrf2與Keap1迅速解離，并從細胞質進入細胞核，與抗氧化反應元件(anti-oxidative response element,ARE)結合[4]。此外，最近的研究還發現，Nrf2信號傳導是抗氧化酶去除活性氧(reactive oxygen species,ROS)和其他有害物質并保護身體免受氧化應激所必需的關鍵途徑[5]。槲皮素(Quercetin)為殼斗科植物伊比利亞櫟的皮和葉中提取的苷類化合物，能夠抑制離體惡性細胞的生長、抑制癌細胞DNA、RNA和蛋白質合成[6]。同時還能抑制血小板聚集和5-羥色胺的釋放，對ADP、凝血酶和血小板活化因子誘導的血小板聚集均有明顯抑制作用。但槲皮素在年齡相關性黃斑變性治療方面研究甚少。本課題將研究槲皮素是否通過Nrf2/Keap1/ARE通路對年齡相關性黃斑變性小鼠具有保護作用，進一步探討其作用機制，為臨床上治療年齡相關性黃斑變性提供新的理論依據。

1材料和方法

1.1材料60只體質量18～22g昆明小鼠購自中國科學院上海斯萊克實驗動物有限公司，本研究經過了我院的倫理審查。SOD試劑盒(批號:CSB-E14981r)、GSH-Px試劑盒(批號:CSB-E12146r)、CAT試劑盒(批號:CSB-EL004563PL)、MDA試劑盒(批號:CSB-E08588r)購于美國CUSABIO公司。RIPA裂解液(批號:R0020-100)購自北京索萊寶科技有限公司。多克隆抗體Nrf2(批號:ab76026)、多克隆抗體Keap1(批號:ab139729)、多克隆抗體LaminB1(批號：ab16048)、單克隆抗體HO-1(批號:ab1894911)、單克隆抗體NQO-1(批號:ab34173)、單克隆抗體GCL(批號:ab207777)、單克隆抗體GAPDH(批號:ab8245)購自美國Abcam公司。山羊抗兔IgG二抗(批號:2985S)和山羊抗鼠IgG二抗(批號:5873S)購自美國Cell Signaling Technology公司。PVDF膜(批號:IPVH08130)購自Millipore公司。HE試劑盒(批號:ZF-0328)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。切片機RM2016(貨號:20160032)購自德國徠卡公司。多功能微孔板讀板機 Molecular Devices(貨號:SpectraMax iD5)購自美國Molecular Devices公司。倒置生物顯微鏡(批號:CKX53)購自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥將60只昆明小鼠在室溫(25℃±2℃)下保持12h黑暗/光照循環飼養。小鼠喂養適量的水和正常的飼料，并且在開始實驗之前使小鼠適應環境至少2wk。將小鼠分別隨機分為3組：對照組、模型組和槲皮素組，每組20只。造模3d后，槲皮素組小鼠給予槲皮素200mg/(kg·d)灌胃治療30d，對照組和模型組則同步給予等體積生理鹽水，每天定點給小鼠灌胃。

1.2.2模型制作參照Sykes等[7]和Hansson[8]方法制作光損傷裝置。光照箱的上方安裝排風孔，下方安裝排氣孔，并且在箱內放置兩個有機玻璃透明箱，其體積為40cm×25cm×25cm。光照箱的每個面都安裝白色熒光燈管，且箱內中心向各方向照度2000Lx，箱內的溫度應與動物房間內的溫度一致，控制在23℃～27℃。小鼠均在12h明(20～50Lx)和12h暗(0～12Lx)的循環光環境中適應7d，在玻璃乙醚麻醉缸中逐只放入小鼠約3min進行吸入麻醉，待小鼠麻醉后，縫線開瞼。小鼠清醒后逐只進入光照箱，接受12h持續光照射。光照結束后立即拆除開瞼縫線，送回暗環境中。實驗前預留出正常小鼠。在造模過程中，模型組死亡1只小鼠。造模結束后進行眼底照相檢查：小鼠眼底出現大量黃白色似玻璃膜疣物質，說明造模成功，可進行后續的實驗。

1.2.3小鼠眼底檢查和OCT檢查小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用Retina Imaging System給小鼠眼底照相。使用SD-OCT檢測小鼠視網膜厚度。

1.2.4 HE染色觀察小鼠視網膜形態的改變取小鼠視網膜標本，在4%多聚甲醛溶液中固定過夜。脫水后，石蠟包埋，切片，厚度為4μm，并在65℃下烘烤1h。接下來，將切片脫蠟并用蘇木精和曙紅染色。最后，在倒置顯微鏡下觀察視網膜形態的改變情況。

1.2.5 FFA觀察小鼠眼底血管完整性小鼠麻醉后用復方托吡卡胺滴眼液進行散瞳，腹腔注射熒光素溶液，在注射5min后定量熒光素滲漏斑點。

1.2.6小鼠視網膜電圖使用Espion視覺電生理系統記錄視網膜電圖。將小鼠暗適應過夜，用強度為600(cd·s)/m2的Ganzfeld光刺激器通過閃光刺激引發視網膜電圖。記錄并分析雙眼中的a波和b波振幅。

1.2.7小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性和ROS、MDA含量測定實驗結束后，各組小鼠眼球采血于離心管中，待凝固后，3000r/min，離心15min，分離血清，采用ELISA試劑盒測定各組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量，ROS檢測采用Fenton反應及Griess試劑顯色法測定。

1.2.8 Western blot檢測小鼠視網膜組織中Nrf2、Keap-1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白的表達取小鼠視網膜組織于離心管中，加入1mL制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。取等量蛋白質樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質后轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1h，之后加入稀釋后的Nrf2、Keap1、LaminB、HO-1、NQO-1、GCL和GAPDH一抗，4℃搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10min，加入對應于一抗種屬來源的HRP標記的二抗，在室溫搖床上孵育1h，用TBST洗膜3次，每次10min。使用ECL化學發光液顯色發光，凝膠成像系統拍照，Image Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

圖1各組小鼠眼底照相及OCT檢查結果A：各組小鼠眼底照相結果，紅色箭頭指向黃白色似玻璃膜疣物質；B：各組小鼠OCT檢查結果。aP<0.05vs對照組，cP<0.05vs模型組。

計算機直接制版(Computer to Plate)最早是由照相直接制版發展而來的。所有制版設備都是采用計算機控制的激光掃描成像，然后通過顯影、定影等工序成印版。這一技術使文字、圖像轉變成數字，免去了膠片這一中間媒介，減少了中間過程的質量損失和材料消耗。湖北省103個縣（市、區）地理國情普查掛圖采用計算機直接制版技術(CTP技術)，有一下幾點關鍵技術：

2結果

2.1三組小鼠眼底及視網膜厚度的變化眼底照相結果顯示：對照組小鼠眼底未見黃白色似玻璃膜疣物質；模型組小鼠眼底出現大量黃白色似玻璃膜疣物質，說明造模成功；槲皮素組小鼠眼底出現黃白色似玻璃膜疣物質，但較模型組明顯減少，見圖1A。OCT檢查結果顯示，對照組、模型組、槲皮素組小鼠視網膜厚度分別為319.23±12.34、234.46±11.23、300.56±12.12μm，差異有統計學意義(F=18.082，P<0.05)。與對照組相比，模型組小鼠視網膜厚度減少(P<0.05)；與模型組相比，槲皮素組小鼠視網膜厚度增加(P<0.05)，見圖1B。

2.2槲皮素對小鼠眼底血管完整性的影響FFA結果顯示：對照組、模型組、槲皮素組小鼠視網膜血管滲漏點分別為4.34±0.98、28.56±1.45、17.78±1.23個，差異具有統計學意義(F=57.367，P<0.001)。對照組小鼠的視網膜血管無滲漏現象發生，與對照組相比，模型組小鼠的視網膜血管發生滲漏，可以看見明顯的滲漏點(P<0.001)；與模型組比較，槲皮素組小鼠視網膜血管發生滲漏，但滲漏點較模型組明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.3槲皮素對小鼠視網膜電圖的影響視網膜電圖結果顯示：對照組、模型組、槲皮素組小鼠a波振幅、b波振幅差異均具有統計學意義(F=60.547，P<0.001；F=62.645，P<0.001)。與對照組比較，模型組小鼠a波振幅、b波振幅均顯著下降(P<0.001)；與模型組比較，槲皮素組小鼠a波振幅、b波振幅均明顯上升(P<0.01)，見圖3，表1。

2.4槲皮素對小鼠視網膜形態改變的影響HE染色結果顯示：對照組小鼠視網膜各層結構清晰，無壞死脫落現象；模型組小鼠視網膜各層結構不清晰，部分發生壞死脫落；槲皮素組小鼠視網膜結構比較清晰，部分外核層發生壞死脫落，見圖4。

2.5槲皮素對小鼠血清中ROS、MDA含量的影響Griess試劑顯色法結果顯示，對照組、模型組、槲皮素組小鼠血清中ROS含量差異具有統計學意義(F=20.563，P<0.01)。與對照組相比，模型組小鼠血清中ROS含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，槲皮素組小鼠血清中ROS含量降低(P<0.05)。ELISA結果顯示，對照組、模型組、槲皮素組小鼠血清中MDA含量差異具有統計學意義(F=36.678，P<0.001)。與對照組相比，模型組小鼠血清中MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，槲皮素組小鼠血清中MDA含量降低(P<0.01)，見圖5，表2。

圖2FFA檢查各組小鼠眼底血管完整性bP<0.001vs對照組，cP<0.05vs模型組。

圖3各組小鼠視網膜a波和b波振幅結果bP<0.001vs對照組，dP<0.01vs模型組。

圖4HE染色觀察各組小鼠視網膜形態的改變(×100)A:對照組；B：模型組；C：槲皮素組。

組別na波b波對照組2098.34±1.87138.23±2.02模型組1918.56±1.01b43.67±1.45b槲皮素組2064.21±1.12d108.98±1.56d

注：bP<0.001vs對照組，dP<0.01vs模型組。

2.6槲皮素對小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性的影響ELISA結果顯示，對照組、模型組、槲皮素組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性差異具有統計學意義(F=20.457，P<0.01；F=59.487，P<0.001；F=57.452，P<0.001)。與對照組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，槲皮素組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性提高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，見圖6和表3。

組別nROS(熒光強度)MDA(nmol/mL)對照組201502.56±28.5413.45±0.78模型組194001.75±35.67b29.78±0.99b槲皮素組202453.67±29.78c19.87±0.86d

注：bP<0.01與對照組；cP<0.05，dP<0.01vs模型組。

2.7槲皮素對小鼠視網膜中Nrf2蛋白表達的影響Western blot結果表明，對照組、模型組、槲皮素組小鼠視網膜中Nrf2蛋白表達差異均具有統計學意義(F=56.023，P<0.001；F=58.459，P<0.001)。與對照組相比，模型組小鼠視網膜細胞質中Nrf2蛋白表達下調(P<0.001)，細胞核中Nrf2蛋白表達上調(P<0.001)；與模型組相比，槲皮素組小鼠視網膜細胞質中Nrf2蛋白表達上調(P<0.05)，細胞核中Nrf2蛋白表達下調(P<0.05)，見圖7和表4。

圖5各組小鼠血清中ROS、MDA含量的變化A：ROS；B：MDA。bP<0.01vs對照組；cP<0.05，dP<0.01vs模型組。

圖6ELISA檢測各組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性的表達A: SOD； B: GSH-Px； C:CAT。bP<0.01vs對照組；cP<0.05，dP<0.01vs模型組。

圖7Western blot 檢測各組小鼠視網膜中Nrf2蛋白表達情況A、C：各組小鼠視網膜細胞質中Nrf2蛋白表達情況；B、D：各組小鼠視網膜細胞核中Nrf2蛋白表達情況。bP<0.001vs對照組，cP<0.05vs模型組。

組別nSODGSH-PxCAT對照組2037.89±1.76112.56±1.3412.38±1.25模型組1919.04±1.45b53.67±0.89b5.97±1.02b槲皮素組2031.56±1.23c78.96±0.79d8.65±1.03c

注：bP<0.01vs對照組；cP<0.05，dP<0.01vs模型組。

組別nNrf2/GAPDHNrf2/LaminB對照組200.61±0.130.53±0.09模型組190.28±0.07b0.79±0.07b槲皮素組200.43±0.06c0.63±0.05c

注：bP<0.001vs對照組，cP<0.05vs模型組。

2.8槲皮素對小鼠視網膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達的影響Western blot結果表明，對照組、模型組、槲皮素組小鼠視網膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達差異均具有統計學意義(F=26.621，P<0.01；F=30.421，P<0.01；F=46.785，P<0.001；F=40.123，P<0.001)。與對照組相比，模型組小鼠視網膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達均上調(P<0.01)；與模型組相比，槲皮素組小鼠視網膜中Keap1、NQO-1、GCL蛋白表達均下調(P<0.05，P<0.001，P<0.01)，見圖8和表5。

3討論

ARMD是一種復雜的神經退行性疾病，導致老年人視力喪失。ARMD的發展是基于年齡相關的視網膜色素上皮細胞(RPE)和脈絡膜毛細血管的變化，但是從典型的年齡相關變化向病理過程的轉變的確切機制仍然知之甚少。ARMD的特征在于神經元和光感受器的進展性喪失，從而導致失明。視網膜細胞死亡受復雜機制控制，目前尚不清楚。這種狀況阻礙了ARMD有效治療的發展[9]。

圖8Western blot 檢測各組小鼠視網膜中Keap-1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達情況bP<0.01vs對照組；cP<0.05，dP<0.01vs模型組。

組別nKeap-1/GAPDHHO-1/GAPDHNQO-1/GAPDHGCL/GAPDH對照組200.29±0.130.45±0.170.25±0.120.19±0.06模型組190.56±0.14b0.75±0.14b0.58±0.13b0.40±0.09b槲皮素組200.36±0.98c0.61±0.160.32±0.08d0.27±0.07d

注：bP<0.01vs對照組；cP<0.05，dP<0.01vs模型組。

研究表明，Nrf2/Keap1/ARE信號通路是細胞中抗氧化應激重要的信號通路。研究發現，在正常情況下，Nrf2和Keap1結合在一起并存在于細胞質中。當受到氧化應激時，這種穩態狀態被打破，Nrf2和Keap1形成的二聚體被打破，Nrf2和Keap1分離，Nrf2迅速從細胞漿進入到細胞核，與ARE結合，啟動其下游靶基因，調節SOD、GSH-Px、CAT、HO-1、NQO-1、GCL等的轉錄活性[10]。其中這些酶可降低血清中MDA含量，清除細胞內ROS，從而發揮抗氧化作用，減輕氧化損傷，降低機體內氧化應激狀態[11]。氧化應激能導致視網膜功能障礙和變性，與ARMD相關，減輕氧化應激是認為治療視網膜疾病有效的方法。

槲皮素又名槲皮黃素，是一種黃酮類化合物，其以苷的形式存在于大多數植物的花、葉、果實。研究證實，槲皮素具有抗炎、清除自由基、抗氧化、抑制新生血管生成等作用[12]。Xu等[13]研究發現，槲皮素磷脂復合物能使氧化損傷的視網膜色素細胞中Nrf2通路相關蛋白和其下游抗氧化酶及Ⅱ相代謝酶提高，從而發揮抗氧化作用，說明槲皮素對于年齡相關性黃斑變性的治療具有潛在價值。在本實驗室前期的實驗中，我們發現槲皮素對年齡相關性黃斑變性有一定的治療作用，其中當槲皮素的劑量為200mg/kg作用效果最佳，因此，后續實驗選擇此濃度。

在本實驗中，我們先進行了眼底照相，結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠眼底出現大量黃白色似玻璃膜疣物質且視網膜厚度減少，然而槲皮素可以減少小鼠眼底的黃白色似玻璃膜疣物質減少且增加視網膜厚度，提示造模成功且槲皮素對年齡相關性黃斑變性有一定的治療作用。OCT實驗結果表明，與對照組相比，模型組小鼠的視網膜血管發生明顯滲漏，槲皮素組小鼠視網膜血管發生滲漏，但滲漏面積較模型組明顯減少。在小鼠視網膜電圖中我們發現，與對照組比較，模型組小鼠a波振幅、b波振幅均顯著下降，與模型組比較，槲皮素組小鼠a波振幅、b波振幅均明顯上升。HE染色結果表明，對照組小鼠視網膜各層結構清晰，無壞死脫落現象，模型組小鼠視網膜各層結構不清晰，部分發生壞死脫落，槲皮素組小鼠視網膜結構比較清晰，部分外核層發生壞死脫落。ELISA實驗顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中ROS、MDA含量明顯增加，SOD、GSH-Px、CAT活性明顯下降，與模型組相比，槲皮素組小鼠血清中ROS、MDA含量降低，SOD、GSH-Px、CAT活性提高，提示槲皮素可以減輕氧化應激反應，對年齡相關性黃斑變性有保護作用。進一步探討了槲皮素對Nrf2/Keap1/ARE信號途徑的作用，結果表明，與對照組相比，模型組小鼠視網膜細胞質中Nrf2蛋白表達下調，細胞核中Nrf2蛋白表達上調，與模型組相比，槲皮素組小鼠視網膜細胞質中Nrf2蛋白表達上調，細胞核中Nrf2蛋白表達下調。與對照組相比，模型組小鼠視網膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達上調，與模型組相比，槲皮素組小鼠視網膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達下調。因此，槲皮素通過Nrf2/Keap1/ARE通路對年齡相關性黃斑變性具有保護作用。

綜上所述，槲皮素通過Nrf2/Keap1/ARE通路，改善視網膜光損傷后的氧化應激狀態，保護視網膜功能，對年齡相關性黃斑變性具有保護作用。因此，槲皮素在年齡相關性黃斑變性的治療和預后方面帶來新的應用。