實時直接分析-靜電場軌道阱高分辨質譜法應用于化妝品中15種抗過敏藥物的定性和定量分析

藍 草，邵琳智，徐 娟

(廣州海關技術中心，廣州 510623)

隨著社會經濟的不斷發展和人們生活水平的不斷提高，化妝品已經成為人們日常生活的必需品和美化生活的時尚產品，因此，人們對化妝品的功效和質量提出了更高的要求[1-2]。抗組胺類藥物是皮膚科常用的抗過敏藥物，常應用于濕疹、藥疹、接觸性皮炎及皮膚瘙癢癥等發癢性皮膚病的治療。長期使用含有抗組胺藥物的化妝品會導致藥物依賴性皮炎，只要停用，過敏癥狀就會加重，可能引起毛細血管擴張、萎縮，皮膚變薄、色素沉著、皮炎等癥狀或人體內激素水平變化造成的內分泌混亂、月經不調等不良反應[3-4]。因此，我國《化妝品衛生規范》[5]規定:地氯雷他定等15種抗過敏藥物不得作為生產原料及組分添加到化妝品中。

目前，化妝品中抗過敏類藥物的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-8]和液相色譜-質譜法[4，9-11]，但這些方法通常需要較長的分析時間，或具有較強的基質干擾、易造成儀器的污染等缺點。

實時直接分析法(DART)是較早實現商品化的一種常壓敞開式離子化方法。這種分析方法無需色譜分離，具有直接、快速、不需樣品預處理或只需簡單預處理等特點，可在幾秒內完成數據分析與采集，實現了高通量的樣品檢測和篩查分析，常被應用于食品藥品非法添加及殘留[12]、司法鑒定[13-14]、成分分析[15]等領域。DART 利用輝光放電產生的激發態氦或氮作為離子化試劑與待測物接觸，通過彭寧離子化、質子轉移以及電荷交換等過程使待測物離子化，然后采用質譜進行檢測，從而實現樣品的實時直接分析[16-17]。

靜電場軌道阱高分辨質譜(Q Exactive-Orbitrap MS)技術在其掃描質量范圍內可提供目標化合物的精確質量數，其靈敏度不及高端三重四極桿質譜的，但Q Exactive-Orbitrap MS具有質量分辨率高、數據庫建立和檢索方便、樣品組織基質干擾少、操作便利性高、不需要設定時間窗口等優點，在定性篩查、定量分析中具有廣泛的應用前景。

DART 離子源作為一種軟電離技術，其與高分辨質譜的聯用，能得到具有精確質量數的準分子離子峰和豐富的碎片離子。本工作采用實時直接分析-靜電場軌道阱高分辨質譜法，研究建立了化妝品中15種抗過敏藥物的快速篩查及確證方法。通過匹配自建譜庫，篩查出非法添加的抗過敏藥物，再進行確證定量。該方法無需復雜的樣品前處理和耗時的色譜分離，大大減少了化學溶劑的使用量，大幅度縮短樣品的分析周期，避免了樣品基質的干擾，并且降低了對儀器的污染程度[18-19]，能夠快速、準確地得到各種基質的化妝品中抗過敏藥物含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive型靜電軌道阱質譜儀；DART SVP型實時直接分析離子源；BT124S型分析天平；1-14型高速離心機；3-30K 型高速離心機；MS3 basic型漩渦振蕩器；SW 30H 型超聲波水浴。

單標準儲備溶液:稱取15種抗過敏藥物標準品各10 mg，分別用甲醇溶解并定容至100.0 mL，配制成100 mg·L－1的標準儲備溶液，于－20 ℃避光保存。使用時，用甲醇將其稀釋至所需質量濃度，現配現用。

地氯雷他定、氯苯那敏、阿斯咪唑、曲吡那敏、溴苯那敏、苯海拉明、異丙嗪、羥嗪、奮乃靜、西替利嗪、氟奮乃靜、氯丙嗪、氯雷他定、特非那定、賽庚啶等15種標準品的純度均不小于98.0%；乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇為高效液相色譜級；甲酸為專業分析級；其他試劑均為國產分析純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)DART 條件 正離子模式；離子化氣體為高純氦氣(純度為99.999%)，氦氣的流量為3 L·min－1；氣體離子化溫度為500 ℃；進樣模式為12 Dip-it Samplers，進樣量為1μL，進樣速率為0.3 mm·s－1；離子源出口距質譜進口約10 mm。

2)質譜條件(定性篩查) 正離子模式；一級全掃描-數據依賴性二級掃描模式(Full MS-dd MS2)；掃描范圍m/z100～1 000；一級全掃描分辨率70 000；吹掃氣流量7.00 mL·min－1；離子最大容納數量1×106；離子最大注入時間100 ms；二級掃描分辨率17 500；離子最大容納數量2×105；離子最大注入時間100 ms。

3)質譜條件(確證) 平行反應監測模式(PRM)；掃描分辨率17 500；離子最大容納數量2×105；離子最大注入時間100 ms；母離子、子離子和歸一化碰撞能量見表1，其中“?”為定量離子對。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取0.50 g試樣于15 mL離心管中，加入50%(體積分數，下同)乙醇溶液1.0 mL 置于超聲波水浴中超聲5 min，渦旋振蕩10 min，以10 000 r·min－1的轉速離心5 min，取上清液0.5 mL 至1.5 mL塑料離心管中，加入0.5 mL 水，渦旋混勻，以10 000 r·min－1的轉速離心5 min，上清液按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

15種抗過敏藥物均易得到質子，因此采用正離子模式進行分析。在采用Full MS-dd MS2掃描時，階梯式的歸一化碰撞能量可得到低、中、高等3種碰撞能量下的樣品二級質譜的疊加圖，能夠得到較為豐富的碎片離子信息。試驗考察了歸一化碰撞能量分別為(20，40，60)，(20，40，80)，(20，40，100)和(10，40，100)時對15 種抗過敏藥物二級質譜的影響。結果表明:在歸一化碰撞能量為(10，40，100)時，15種抗過敏藥物均能夠得到較好的二級質譜信息。此二級質譜信息可用于定性篩查譜庫的建立，同時得到的子離子信息可為目標物的測定做準備。

2.2 DART條件的優化

2.2.1 離子化溫度

DART 離子源需要高溫才能使激發態的惰性氣體解析并瞬間離子化待測化合物，因此離子化溫度是非常重要的參數，過高和過低的溫度均會影響DART 的離子化效率和背景噪音，高溫會加速待測樣品的熱解吸率，使更多的待測樣品進入質譜檢測器，增強目標物的響應。然而，過高的溫度會導致待測樣品在熱解過程中被降解，靈敏度降低[14]。因此，試驗考察了離子化溫度分別為300，400，500 ℃時對15種抗過敏藥物的響應情況的影響，結果見圖1。

圖1 不同離子化溫度下的選擇離子流圖Fig.1 SIC chromatogram under various ionization temperatures

由圖1 可以看出:離子化溫度為500 ℃時，15種抗過敏藥物的響應最高，試驗選擇的離子化溫度為500 ℃。

2.2.2 樣品傳輸速度

DART 軟件能通過控制線性軌道上Dip-it玻璃棒的移動速度來控制待測樣品在離子化區域的停留時間，進而影響著樣品的峰形和響應強度。DART 軟件推薦的樣品傳輸速度為0.2～0.6 mm·s－1，因此，試驗考察了樣品傳輸速度分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mm·s－1時對15種抗過敏藥物的峰形和離子響應強度的影響。結果表明，樣品傳輸速度越快，峰形越尖銳；但當傳輸速度過快時，離子化氣體與樣品接觸時間過短，導致離子化效率低，響應降低；樣品傳輸速度過慢時，峰形較寬，響應也較低；樣品傳輸速度為0.3，0.4，0.5 mm·s－1時，15種抗過敏藥物的響應差別不大，但樣品傳輸速度越慢，信號越穩定，掃描點數多，定量也更準確。因此，試驗選擇樣品傳輸速度為0.3 mm·s－1。

2.2.3 提取溶劑

當分別采用甲醇、乙醇和乙腈對加標樣品進行提取時，發現上述溶劑較易揮發和擴散，得到的響應較低且不穩定、峰形較差。由于3種有機溶劑中待測物響應值差別不大，試驗選取毒性較小的乙醇和其他介質進行摻雜，以改善上述問題。試驗考察了乙醇、50%乙醇溶液和體積比為1∶1的乙醇-異丙醇溶液對待測物響應值的影響，結果見圖2。

圖2 溶劑對分析物響應值的影響Fig.2 Effect of the solvent on the response of the analyte

由圖2可知:稀釋后的乙醇溶液響應更高，峰形也較純溶劑的更尖銳，可能是因為稀釋液的加入使提取液液滴更不容易揮發和擴散，離子化效率變好。綜合考慮響應、峰形、毒性和成本等因素，試驗選擇50%乙醇溶液為提取溶劑。

2.3 15種抗過敏藥物的定性分析

按照儀器工作條件，分別對15種抗過敏藥物進行Full MS-dd MS2模式掃描，得到15種抗過敏藥物的二級質譜圖，見圖3。采用mz Vault軟件自建標準二級譜庫，將二級質譜圖導入到自建二級譜庫進行分析，設置提取質量窗口的質量偏差為5×10－6，保留時間偏移0.5 min，最小響應50 000，軟件匹配度不小于90%。

圖3 15種抗過敏藥物的二級質譜圖Fig.3 MS2 spectra of the 15 anti-allergics

2.4 標準曲線和測定下限

在定性篩查后，又對篩查后的藥物進行了測定。以樣品為基質配制0，0.25，0.5，1.0，2.0，5.0，10 mg·L－1的混合標準溶液系列，放置30 min，使加入的標準溶液與樣品充分混合。按照儀器工作條件進行測定，以15種藥物的質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，15種藥物標準曲線的線性范圍在10 mg·L－1以內，其線性回歸方程、相關系數見表2。

在空白樣品中添加15種抗過敏藥物混合標準溶液，測得的信噪比遠遠大于10，按照《化妝品安全技術規范》中要求，把本方法的測定下限設為0.5 mg·kg－1。

表2 線性參數Tab.2 Linearity parameters

2.5 精密度和回收試驗

在空白化妝品樣品中進行3個濃度水平的加標回收試驗，每一水平設6個平行樣，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表3。

由表3 可知:RSD 為6.3%～15%；回收率為82.3%～128%，方法的準確度和精密度滿足定量分析的要求。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對20個市售化妝品進行測定，其中，7個樣品檢出苯海拉明，1個樣品檢出氯苯那敏，檢測結果和自建二級譜庫匹配度均大于90%。同時，對本方法的測定結果和《化妝品安全技術規范》(2015 版)[5]中的液相色譜-串聯質譜法(LCMS/MS)的進行了比對，發現兩者結果一致，表明本方法有較好的準確度。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6) %

本方法采用DART-Q-Exative-orbitrap MS 建立了一種化妝品中15種抗過敏藥物的快速篩查及定量分析方法。該方法樣品簡單、快速，且試驗結果與LC-MS/MS[5]的一致，具有廣闊的應用前景。