黑水虻卵胚胎發育過程及在生產上的應用

莫文艷，王鳳英，王國霞，胡俊茹，黃燕華*

(1. 廣東省農業科學院動物科學研究所，廣州 510640；2. 農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室，廣州 510640；3. 廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640；4. 廣州安芮潔環保科技有限公司，廣州 510450)

黑水虻HermetiaillucensL.是雙翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻屬Hermetia昆蟲，又名亮斑扁角水虻，幼蟲在自然界以動物糞便、腐爛的有機物，如腐肉、瓜果蔬菜和植物性垃圾為食，將這些廢棄物轉化為自身生物量，生產高價值的蛋白質飼料，具有廣闊前景(喻國輝等，2014；胡俊茹等，2018)。因其具有繁殖能力強、生長速度快、轉化效率高等特點，已成為當前極具開發潛力的資源昆蟲(柴志強等，2012；徐齊云等，2014；易昌金等，2018)。目前，對黑水虻幼蟲和成蟲的生物學特性已有一些研究(常向前等，2017；Tomberlinetal.，2002；Dieneretal.，2009)，但有關其蟲卵胚胎發育的研究還未見報道。姬越等對黑水虻人工飼養的適宜溫度進行研究，結果表明，黑水虻卵最佳孵化溫度為32℃，在此溫度下具有最高的孵化率和最短的孵化期(姬越等，2017)。本研究在32℃下觀察黑水虻卵的胚胎發育，記錄各時期的主要特征，結合蟲卵發育的積溫法則，死亡蟲卵的特征，可以判斷蟲卵胚胎發育階段，預估蟲卵孵化時間和孵化率，豐富了黑水虻發育學和昆蟲生產學的研究內容，同時理論結合實際，為黑水虻卵的人工孵化技術研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 黑水虻卵胚胎發育過程觀察

黑水虻卵取自廣州飛禧特生物科技有限公司中試基地成蟲棚。幼蟲取食餐廚垃圾，飼養溫度為30±2℃。成蟲的飼養溫度為30±3℃，相對濕度為50%～90%，自然光照，白天光照強度為2 000～20 000 Lux。待成蟲交配產卵，采集集卵板上的初產卵塊置于培養皿內，在光周期L ∶D=14 ∶10，溫度為32℃，濕度為80%的人工氣候箱中(寧波賽福實驗儀器有限公司，PRX-350B)進行培養。每隔0.5 h取出孵化中的胚胎，用顯微鏡放大50倍(10倍目鏡，5倍物鏡)觀察(卡爾蔡司光學(中國)有限公司，AxioScopeA1)胚胎發育情況，利用AxioVision軟件拍照，拍照完畢放回氣候箱繼續培養。

1.2 黑水虻卵胚胎發育研究在生產上的應用

黑水虻卵聚產，稱量0.0100 g初產蟲卵，用酒精泡散后計數，得出單克初產蟲卵的粒數為40 000～42 000粒，采用1 g卵41 000個卵粒進行后續計算。每一批次蟲卵待孵化前，隨機取樣3份，在分析天平上稱取0.0100±0.0050 g蟲卵置于載玻片中央，用不銹鋼小勺將卵塊輕輕推散，用生物顯微鏡(廣州博冠光電科技股份有限公司，605F02)觀察記錄蟲卵發育階段、蟲卵發育整齊度、計算蟲卵死亡率后將玻片置于溫度為32℃，濕度為80%的氣候箱內孵化，蟲卵孵化完畢后，數出未孵化的卵數計算孵化率。

孵化率(%)=(100-未孵卵數)/100×100

2 結果與分析

2.1 黑水虻卵胚胎發育過程

黑水虻卵呈長橢圓形，長徑955.15±24.75 μm，短徑216.90±6.22 μm。剛產出的卵呈乳白色，隨著胚胎發育的進行逐漸變為黃色。在32℃環境中，借鑒王進忠等對黏蟲胚胎發育各階段的劃分方法和描述(王進忠等，1997)，將黑水虻胚胎發育分為卵裂期、胚盤胚帶形成期、原腸形成期、胚體分節期、體壁形成期、器官形成期6個連續時期，歷時51 h完成整個胚胎發育過程。詳細胚胎發育時序見表1，此發育時序表有助于判斷黑水虻存活率以及預測孵化時間。

2.1.1卵裂期(圖版A)

黑水虻蟲卵的合子核經有絲分裂，形成許多卵裂核，細胞質包裹卵裂核形成合胞體，顯微鏡下可觀察到胚胎中部有大量卵黃顆粒。

2.1.2胚盤胚帶形成期(圖版B, C, D, E)

胚胎發育4 h，卵裂期形成的活質體在卵周質層排列成多核體層，包圍內部卵黃，顯微鏡內觀察到四周有空隙的蟲卵形態。胚盤形成后(圖B)，卵內腹部胚盤細胞分裂加速，背部形成向初級背器(圖C)。胚胎發育5 h，形成胚帶，而后下部胚盤內陷形成胚外膜(圖D)。胚帶形成后，胚胎逐漸向卵內部陷入，至胚胎發育的8.5 h，形成“瓶”狀的胚帶(圖E)，以后瓶上方端發育為胚胎的頭部，下端發育為胚胎的腹部。

表1 黑水虻卵胚胎發育時序

圖1 黑水虻卵胚胎發育過程Fig.1 The embryonic developmental process of black soldier fly注：卵裂期，A；胚盤胚帶形成期，B、C、D、E；原腸形成期，F、G；胚體分節期，H、I；體壁形成期，I、J、K；器官形成期，K、L、M、N、O、P。Note: Cleavage stage, A; blastoderm embryo formation stage, B, C, D, E; primitive intestinal formation stage, F, G; embryo body segmentation stage, H, I; integument formation stage, I, J, K; organ formation stage, K, L, M, N, O, P.

2.1.3原腸形成期(圖版F, G)

胚胎發育的11.5 h，出現原腸溝，原腸溝兩側不斷向胚體中部擴展，歷經2 h，形成不封閉的原腸。原腸形成后，胚體分為兩個胚層。貼近胚體腹部的胚層較薄，為單層細胞即外胚層，將來發育成表皮及其衍生物、神經系統、消化道兩端等，遠離腹部胚層較厚，為細胞群即中胚層，將來發育為真皮、肌肉、性腺組織等。

2.1.4胚體分節期(圖版H, I)

胚體發育16.5 h，分化出明顯的原頭、原軀，外胚層的胚帶上出現很多橫溝。同時期，胚體前端分節內陷形成口道，胚體后端內陷形成肛道。

2.1.5體壁形成期(圖版I, J, K)

胚體發育30 h時，出現淡紅色眼點，同時體壁背合開始，胚體后端的外胚層從兩側向上包圍卵中部的卵黃，歷經5 h，在背面匯合。

2.1.6器官形成期(L, M, N)

消化道發育：胚胎發育28.5 h時，胚體尾端的外胚層內陷形成肛陷，體壁背合過程中，位于原腸兩端的內胚層細胞相向發育，形成最終中腸，體壁背合完成后，無法再繼續觀察消化道的發育情況。神經系統發育：胚體發育35 h，神經系統發育完成，胸部胸神經塊明顯。循壞系統發育：胚體發育40.5 h，循環系統形成，背血管明顯，43.5 h時，可觀察到心臟跳動。呼吸系統發育：產卵后44.5 h，氣管形成，黑色主氣管明顯。

2.2 黑水虻卵胚胎發育在生產上的應用

通過鏡檢技術對每一批次待孵化蟲卵進行鏡檢觀察，初步判定該批次待孵化蟲卵所處的發育階段、發育整齊度和蟲卵死亡率。發育階段異常、發育整齊度差或死亡率高于生產要求則進行相應的處理，避免后期孵化過程中造成人力和物力的大量浪費。從蟲卵胚胎發育圖制定以來，筆者所在項目組每天對蟲卵進行鏡檢，下表2為2018年每月的蟲卵鏡檢情況(均值)。基地在每天18 ∶00采收蟲卵，采收的蟲卵保存溫度為20～30℃，濕度為60%～80%的房間內，早上8 ∶00鏡檢蟲卵。

表2 黑水虻卵鏡檢數據記錄

3 結論與討論

對于胚胎發育的研究，研究者們通常用固定液將待研究卵固定、經過一系列的處理去掉卵殼后再進行胚胎發育的觀察(Tomberlinetal.，2002；李冰楊等，2008；寇利軒，2016)。黑水虻蟲卵個體小、卵殼薄、且發育歷期較短，各發育階段典型特征明顯，因此本實驗對蟲卵未進行任何處理，在其自然孵化的條件下進行觀察，步驟簡單、操作簡便，更加切合生產中的實際應用。

黑水虻幼蟲屬于無足型幼蟲，在胚胎發育過程中，未觀察到明顯胸腹部附肢形成的特征，隨著胚體的發育，在產卵后的37.5 h，咀嚼式口器以及觸角發育完成。許多昆蟲在胚胎發育過程中，胚體為更好的吸收卵黃營養，會發生胚體反轉現象(趙欣平等，1990；張群玲等，1998；崔雙雙等，2011)。黑水虻的胚動無反轉現象，只是在胚體上升期時，貼近腹面的胚帶尾端向卵內部縮回，胚體變短，而后胚帶頭端向卵內部移動，在胚體下降期時，胚帶頭端又回到腹部，而后胚帶拉長，胚帶尾端慢慢向原來位置縮回。

在對黑水虻卵鏡檢的過程中，針對出現的異常情況進行分析，尋找原因，可以豐富黑水虻卵孵化機制的研究。對蟲卵發育進行持續觀察，發現正常幼蟲出殼前尾部會分泌一種疑似具有溶解卵殼功能的液體，幼蟲通過蠕動身體把部分液體擠到頭頂，利用口器持續頂頭頂卵殼，直到出現裂縫，幼蟲從卵殼中爬出。實際生產中通過鏡檢發現存在胚胎已發育完全、幼蟲在蠕動但未能破殼的現象，可能是因為胚胎發育過程中受到某種應激而導致其破殼不成功，可能是分泌的液體不夠，也可能是自身的力量不夠，具體原因還需進一步研究。

在實際生產鏡檢中發現，成蟲繁育的溫濕度以及蟲卵采收后的保存溫濕度，對黑水虻卵的發育階段以及死亡蟲卵占比具有影響。筆者所在項目組2018年10月份改進了成蟲繁育室的溫濕控制系統之后，各月份蟲卵死亡占比明顯低于2018年1月和2月，蟲卵孵化率明顯高于2018年1月、2月，這可能是因為1月、2月成蟲交配過程中溫度偏低會加大未受精卵比率。2018年10月前采收的蟲卵保存在室溫中，10月后采收的蟲卵保存在28～30℃(空調加溫)，濕度為60%～80%(加濕器加濕)的房間內，可以看出恒溫環境中保存的蟲卵發育更加整齊，這可能是因為每批蟲卵的產卵間隔偏長(產卵時間12 ∶00-18 ∶00，約6 h)，先產的蟲卵發育快，環境溫度偏低時，單批卵的發育階段被慢慢拉開，鏡檢到的發育階段為B-D，30℃保存時，鏡檢的發育階段為D-E，相對整齊。6月、7月、8月發育整齊度較差可能是因為產卵間隔期更長所致(產卵時間9 ∶00-18 ∶00，約9 h)。

黑水虻蟲卵胚胎發育特征明顯，使用生物顯微鏡即可對其發育過程進行觀察，所需儀器設備成本低廉，一般的生產企業均有能力購買和應用。蟲卵胚胎發育是黑水虻養殖環節中的的第一步也是極為重要的一步，蟲卵孵化率、初孵幼蟲的活力等參數直接影響后續所有生產流程。后續需繼續對黑水虻蟲卵的孵化機制進行更深一步的研究。