草地貪夜蛾4個性信息素結(jié)合蛋白基因的克隆及表達模式分析

劉 蘇，蔣興川，蔣秀云，陳 誠，孫勁超，沈懌丹，李桂亭，操海群*

(1.作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，植物病蟲害生物學與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，合肥 230036；2.安徽審計職業(yè)學院，合肥 230601)

昆蟲依靠靈敏的嗅覺系統(tǒng)識別外界環(huán)境中的信息化合物。當氣味分子進入昆蟲觸角上的嗅覺感器后，首先被氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)所識別，OBPs攜帶這些疏水性的氣味分子穿越感器淋巴液，將氣味分子運輸至感器深處的氣味受體(odorant receptors，ORs)附近，從而激活ORs，引導昆蟲產(chǎn)生行為反應(杜立嘯等, 2016; 張玉等, 2019)。在鱗翅目昆蟲的OBP家族中，有一類能結(jié)合性信息素的特殊類群，稱為性信息素結(jié)合蛋白(pheromone-binding proteins，PBPs)。首個PBP(ApolPBP1)在多音天蠶Antheraeapolyphemus雄蛾觸角中被發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠結(jié)合多音天蠶的性信息素組分E6, Z11-16Ac、E6, Z11-16Ald和E4, Z9-14Ac(Vogt and Riddiford, 1981; Lealetal., 2005)。隨后，在多種鱗翅目昆蟲中都發(fā)現(xiàn)有PBPs的存在(Britoetal., 2016)。PBPs是一類小分子水溶性蛋白，其序列中的6個半胱氨酸殘基能夠形成3對二硫鍵，從而穩(wěn)定PBPs蛋白的三維結(jié)構(gòu)(Sunetal., 2018)。此外，PBPs蛋白一般具有6個α-螺旋結(jié)構(gòu)，這些α-螺旋形成結(jié)合腔，在PBPs運輸性信息素分子中起重要作用(張玉等, 2019)。

絕大多數(shù)鱗翅目昆蟲如家蠶Bombyxmori、斜紋夜蛾Spodopteralitura、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和二化螟Chilosuppressalis等觸角中都表達多個PBPs，這些PBPs能夠結(jié)合本物種不同種類的性信息素組分，在性信息素通訊中扮演重要角色(Gongetal., 2009; Changetal., 2015; Fengetal., 2015; Yangetal., 2017)。此外，在舞毒蛾Lymantriadispar、桃蛀螟Conogethespunctiferalis和茶尺蠖Ectropisobliqua等昆蟲中還發(fā)現(xiàn)PBPs不僅能結(jié)合性信息素，還能結(jié)合植物揮發(fā)物(賈小儉等, 2015; Yuetal., 2018; Sunetal., 2019)。

由于PBPs與性信息素分子的結(jié)合是昆蟲性信息素通訊的第一步，因此PBPs可以作為潛在的靶標，用于開發(fā)新型的害蟲無公害防治技術(shù)。目前，RNA干擾技術(shù)和基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)已成功應用于沉默或敲除棉鈴蟲、舞毒蛾、斜紋夜蛾和二化螟等的PBPs基因，使試蟲對性信息素的電生理反應顯著降低(Zhuetal., 2016; Yeetal., 2017; Yuetal., 2018; Dongetal., 2019)。此外，有研究人員基于PBP蛋白的結(jié)構(gòu)開發(fā)了高通量的化合物篩選程序，并成功獲得了具有生物活性的引誘劑(Tianetal., 2016)。

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目夜蛾科，是一類雜食性、暴發(fā)性害蟲。此蟲原產(chǎn)美洲，自2016年在非洲被發(fā)現(xiàn)以來，不僅迅速擴撒至撒哈拉以南數(shù)十個國家，而且向亞洲入侵，2019年1月此蟲被確認入侵我國云南省，截至2019年10月，已確認入侵我國26個省、市、自治區(qū)(郭井菲等, 2019; 姜玉英等, 2019; 王磊等, 2019)。草地貪夜蛾在完成初始定殖過程后，預計2020年將進入暴發(fā)為害階段(吳孔明, 2020)。此蟲食性雜、食量大、繁殖力強且遷飛距離遠，對我國糧食安全造成嚴重威脅(齊國君等, 2019; 吳益東等, 2019; 閆文娟等, 2019; 楊普云等, 2019)。明確草地貪夜蛾識別性信息素的分子機制，對于尋找新的靶標、篩選高效引誘劑或嗅覺阻斷劑應用于害蟲防治，均具有重要意義。目前，草地貪夜蛾的性信息素成分已被探明(Unbehendetal., 2013; 江南紀和王琛柱, 2019)，應用性信息素防治草地貪夜蛾也有相關(guān)報道(楊留鵬等, 2020)，但關(guān)于其性信息素通訊分子機制的研究依然匱乏。本實驗從草地貪夜蛾中克隆了4個編碼PBPs的cDNA序列(SfruPBP1-SfruPBP4)，并分析了4個SfruPBPs的序列特征、基因組位置、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以及組織表達模式。本研究結(jié)果為闡明PBPs在草地貪夜蛾性信息素識別中的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試蟲

草地貪夜蛾幼蟲采集自安徽省黃山市黃山區(qū)玉米田(蔣興川等, 2019)。將幼蟲帶回實驗室，在人工氣候箱中飼養(yǎng)。幼蟲飼喂新鮮玉米葉片直至化蛹，羽化后的成蟲飼喂10%蜂蜜水。飼養(yǎng)條件為：溫度26±1℃，相對濕度70%±10%，光暗周期14 h ∶10 h。

1.2 組織收集、總RNA提取與第一鏈cDNA合成

收集羽化后48 h之內(nèi)未交配的雌、雄成蟲，置于冰上10 min后，分離收集不同組織：觸角、去除觸角的頭部、胸、腹、足和翅。使用RNAiso Plus試劑(寶生物，大連)提取各組織的總RNA?？俁NA樣品經(jīng)瓊脂糖電泳分析和NanoDrop 2000微量分光光度計檢測后，使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡，日本)合成第一鏈cDNA。

1.3 同源檢索與基因克隆

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載夜蛾科昆蟲(斜紋夜蛾S.litura、棉鈴蟲H.armigera、甜菜夜蛾S.exigua和小地老虎Agrotisipsilon)的PBPs蛋白序列，以此為模板，利用BioEdit軟件中的TBLASTN程序在草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組(Legeaietal., 2014)中檢索，獲得了草地貪夜蛾4個編碼PBPs的cDNA序列(SfruPBP1-SfruPBP4)。據(jù)此設計基因特異性引物(表1)，使用KOD FX DNA聚合酶(東洋紡，日本)擴增完整開放閱讀框。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶回收，連入pTOPO-Blunt載體(艾德萊生物，北京)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞(全式金，北京)，挑取陽性克隆測序(通用生物，滁州)。

1.4 序列分析與進化樹構(gòu)建

利用DNAstar軟件中的EditSeq模塊將4個SfruPBPs的核酸序列翻譯成蛋白序列，并計算蛋白分子量和等電點。使用Clustal Omega程序進行多序列連配。分泌信號肽使用SignalP 5.0軟件預測。根據(jù)已報道的草地貪夜蛾基因組序列(Liuetal., 2019)，使用Splign程序分析4個SfruPBPs在基因組上的位置以及外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載鱗翅目昆蟲的PBPs蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件以最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建進化樹，并經(jīng)1 000次Bootstrap自舉重復檢驗。

1.5 組織表達模式分析

使用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析4個SfruPBPs在草地貪夜蛾不同組織中的表達模式。所用引物見表1，以草地貪夜蛾核糖體蛋白RpL18作為內(nèi)參基因。PCR酶為2 × Taq Mix(康為世紀，北京)，反應體系20 μL，包括10 μL 2 × Taq Mix、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、1 μL(10 ng)第一鏈cDNA和8 μL ddH2O。反應程序為94℃ 2 min，1個循環(huán)；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條帶的分子量是否與預期一致，并經(jīng)測序確認。

使用實時熒光定量PCR分析SfruPBPs在雌雄觸角中的相對表達水平。所用引物見表1，所用儀器為美國Bio-Rad公司CFX96型實時熒光定量PCR儀。反應體系20 μL，包括SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL(東洋紡，日本)、上下游引物各0.5 μL、第一鏈cDNA 1 μL(10 ng)和8 μL ddH2O。反應程序為95℃ 2 min，1個循環(huán)；95℃ 10 s，60℃ 25 s，40個循環(huán)。反應完成后，溫度從60℃逐步上升至95℃，繪制熔解曲線，以檢測是否存在非特異性擴增及引物二聚體。為探測潛在的污染，每個反應板均包含無cDNA模板的對照和無反轉(zhuǎn)錄酶的對照。實驗設3次生物學重復，基因相對表達量使用2-△△Ct法計算(曹苗苗等, 2018; 董婉瑩等, 2019)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件v9.5版進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用學生氏t測驗比較不同樣本之間的差異顯著性，顯著性水平設為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SfruPBPs序列分析

通過檢索草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組，并經(jīng)過PCR擴增和測序，獲得了4個編碼PBPs的cDNA序列，命名為SfruPBP1-SfruPBP4(已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MN541407-MN541410)。4個SfruPBPs的開放閱讀框介于495 bp～621 bp之間，編碼的蛋白質(zhì)長度介于164～206個氨基酸之間(表2)。BLASTX比對結(jié)果表明，SfruPBP1和SfruPBP4編碼的蛋白分別與斜紋夜蛾P(guān)BP1和PBP4的一致性最高，而SfruPBP2和SfruPBP3編碼的蛋白分別與甜菜夜蛾P(guān)BP2和PBP3的一致性最高(表2)。但4個SfruPBPs編碼的蛋白之間的氨基酸一致性較低，介于25%～51%之間(表3)。

表2 4個SfruPBPs的BLASTX最佳匹配

表3 4個SfruPBPs蛋白之間的氨基酸一致性(%)

圖1 4個SfruPBPs蛋白序列連配Fig. 1 Alignment of the protein sequences of four SfruPBPs注：蛋白序列中的6個保守的半胱氨酸殘基以灰色背景突出顯示，并標注數(shù)字1～6?；疑娇蛑械男懽帜副硎緣A基，大寫字母表示其編碼的氨基酸殘基。斜線表示內(nèi)含子插入位點。內(nèi)含子1插入在編碼兩個氨基酸的密碼子之間，內(nèi)含子2插入在編碼同一個氨基酸的密碼子內(nèi)部。Note：Six positionally conserved cysteines in the protein sequences are highlighted with grey color and marked with numbers 1 to 6. The lowercase letters in the grey boxes represent nucleotides, while uppercase letters represent the deduced amino acids. The slash indicates the intron insertion site. The intron 1 is inserted between two codons, while intron 2 splits a condon.

4個SfruPBPs蛋白的氨基端(N-端)均預測出一段分泌信號肽，暗示它們可能會被分泌出細胞外(圖1)。多序列連配結(jié)果表明，4個SfruPBPs蛋白序列中均具有6個保守的半胱氨酸位點。此外，SfruPBP4蛋白的羧基端(C端)顯著長于其它3個SfruPBPs(圖1)。基于鱗翅目昆蟲PBPs的蛋白序列構(gòu)建了進化樹(圖2)，結(jié)果顯示，草地貪夜蛾SfruPBPs與斜紋夜蛾SlituPBPs和海灰翅夜蛾SlittPBPs親緣關(guān)系最近。此外，4個SfruPBPs分別位于不同的進化分支之中，暗示它們可能具有功能上的分化(圖2)。

2.2 基因結(jié)構(gòu)分析

使用Splign程序?qū)?個SfruPBPs的cDNA序列與草地貪夜蛾的基因組DNA序列進行連配。結(jié)果顯示，4個SfruPBPs均位于10號染色體上(chr10)，呈串聯(lián)排列，序列跨度為8 272 bp(圖3A)。SfruPBP1、SfruPBP2、SfruPBP3和SfruPBP4在基因組上的長度分別為688 bp、1 490 bp、800 bp和1 099 bp，均包含3個外顯子和2個內(nèi)含子(圖3B)。4個SfruPBPs的內(nèi)含子邊界均符合典型的真核生物“GT-AG”規(guī)則(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，4個SfruPBPs均具有保守的內(nèi)含子插入位點，第1個內(nèi)含子插入在編碼兩個氨基酸的密碼子之間，而第2個內(nèi)含子插入在編碼同一個氨基酸的密碼子內(nèi)部(圖1)。

2.3 組織表達模式分析

RT-PCR結(jié)果表明，4個SfruPBPs具有不同的組織表達模式。SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3均在雌雄成蟲觸角中高量表達，而在頭、胸、腹、足、翅等非嗅覺組織中不表達(圖4)。SfruPBP4卻表現(xiàn)出截然不同的表達模式，即在雄成蟲腹部表達，而在觸角和其它組織中不表達(圖4)。使用實時熒光定量PCR進一步檢測了SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在雌雄成蟲觸角中的相對表達水平(因SfruPBP4在觸角中不表達，故未檢測)。結(jié)果顯示，SfruPBP1和SfruPBP2在雄成蟲觸角中的表達水平顯著高于雌成蟲(P<0.05)，而SfruPBP3在雌雄觸角中的表達水平無顯著差異(P> 0.05，圖5)。

圖2 鱗翅目昆蟲PBPs進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of lepidopteran PBPs注：4個SfruPBPs以方框標示。Four SfruPBP genes are boxed. 低于50的自舉值未顯示。Bootstrap values lower than 50 are not shown. 物種名與PBPs登錄號 Species names and GenBank accession numbers of PBPs：草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda：SfruPBP1-SfruPBP4(MN541407-MN541410)；小地老虎Agrotis ipsilon：AipsPBP1-AipsPBP3(AFM36756-AFM36758)；柞蠶Antheraea pernyi：AperPBP1(X96773)，AperPBP2(X96860)，AperPBP3(AJ277265)；多音天蠶Antheraea polyphemus：ApolPBP1(X17559)，ApolPBP2(AJ277266)，ApolPBP3(AJ277267)；臍橙螟Amyelois transitella：AtraPBP1(ACX47890)，AtraPBP2(ACX47891)；家蠶Bombyx mori：BmorPBP1(NM_001044029)，BmorPBP2(XP_012545845)，BmorPBP3(NM_001083626)，BmorPBP4(Vogt et al., 2015)；二化螟Chilo suppressalis：CsupPBP1(GU321120)，CsupPBP2(EU825762)，CsupPBP3(HM190253)，CsupPBP4(Chang et al., 2015)；稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis：CmedPBP1(JN867060)，CmedPBP2(KC507181)，CmedPBP4(KC507185)，CmedPBP5(KP975161)；蘋果褐卷蛾Epiphyas postvittana：EposPBP1(AF416587)，EposPBP2(AF411459)，EposPBP3(EV811597)；棉鈴蟲Helicoverpa armigera：HarmPBP1(HQ436362)，HarmPBP2(HQ436360)，HarmPBP3(AF527054)；煙夜蛾Helicoverpa assulta：HassPBP1(AY864775)，HassPBP2(EU316186)，HassPBP3(DQ286414)；煙芽夜蛾Heliothis virescens：HvirPBP1(X96861)，HvirPBP2(AM403491)；舞毒蛾Lymantria dispar：LdisPBP1(AF007867)，LdisPBP2(AF007868)；煙草天蛾Manduca sexta：MsexPBP1(AF117593)，MsexPBP2(AF117588)，MsexPBP3(AF117581)，MsexPBP4(Vogt et al., 2015)；歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis：OnubPBP1-OnubPBP5(GU826166-GU826170)；亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis：OfurPBP1-OfurPBP5(LC027678-LC027682)；小菜蛾P(guān)lutella xylostella：PxylPBP1(ACI28451)，PxylPBP2(AGH13203)，PxylPBP3(BAG71422)；蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides：SnonPBP1(AAS49922)，SnonPBP2(AAS49923)；大螟Sesamia inferens：SinfPBP1(AEQ30019)，SinfPBP2(AEX58642)，SinfPBP3(AEQ30020)；梨小食心蟲Grapholita molesta：GmolPBP1(AVZ44710)，GmolPBP2(AHZ89398)，GmolPBP3(AHZ89399)；斜紋夜蛾Spodoptera litura：SlituPBP1-SlituPBP4(AIS72933-AIS72935; AXO77502)；茶尺蠖Ectropis obliqua：EoblPBP1(KT991348)，EoblPBP2(KX421383)；桃蛀螟Conogethes punctiferalis：CpunPBP1(MH006604)，CpunPBP2(KP985228)，CpunPBP3(KP985229)，CpunPBP5(KP985227)；云南松毛蟲Dendrolimus houi：DhouPBP1(KC783384)；DhouPBP2(KF487588)；雙委夜蛾Athetis dissimilis：AdisPBP1(KR780029)，AdisPBP2(KR780030)；甘藍夜蛾MbraPBP1(AF051143)，MbraPBP2(AF051142)，MbraPBP4(AF461143)；粘蟲Mythimna separata：MsepPBP1(MH168090)；MsepPBP2(MH168089)；?；页嵋苟闟podoptera littoralis：SlittPBP1-SlittPBP4(Walker et al., 2019)。

圖3 4個SfruPBPs基因在基因組上的分布(A)以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(B)Fig.3 Genomic locations (A) and exon-intron structures (B) of four SfruPBP genes注：括號中的數(shù)字為內(nèi)含子長度。Note：Numbers in parentheses indicate the size of introns.

圖4 SfruPBPs基因在成蟲不同組織中的表達模式Fig.4 Expression pattern of SfruPBPs in various adult tissues注：“頭”表示去除觸角的頭部。Note：“Head” indicates heads without antennae.

圖5 SfruPBPs基因在雌雄成蟲觸角中的相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of SfruPBP genes in male and female antennae注：“*”表示差異顯著，“ns”表示差異不顯著(學生氏t測驗，P<0.05)。Note：“*” indicates significant difference, “ns” stands for not statistically significant (Student’s t-test, P<0.05).

3 結(jié)論與討論

PBPs與進入觸角感器的性信息素分子的結(jié)合是昆蟲性信息素通訊的第一步，因此PBPs對于昆蟲的求偶、交配以及種群繁衍至關(guān)重要。若敲除PBPs基因或抑制其表達，昆蟲對性信息素的嗅覺反應顯著降低(Zhuetal., 2016; Yeetal., 2017; Yuetal., 2018; Dongetal., 2019)。草地貪夜蛾同樣依賴種內(nèi)性信息素完成求偶與交配，其性信息素包括Z9-14: OAc、Z11-16: OAc等多種組分，草地貪夜蛾對這些性信息素組分的識別應當也會需要PBPs的參與(江南紀和王琛柱, 2019)。本研究成功克隆了草地貪夜蛾4個SfruPBPs，并分析了它們的序列特征、基因組位置、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以及組織表達模式。本研究結(jié)果為后續(xù)探索這些基因在性信息素通訊中的功能，以及利用這些基因作為靶標開發(fā)綠色防控技術(shù)奠定了基礎。

不同鱗翅目昆蟲所具有的PBPs基因數(shù)量不同。PBPs基因數(shù)量較多的有歐洲玉米螟Ostrinianubilalis(5個)、亞洲玉米螟O.furnacalis(5個)、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis(5個)、二化螟C.suppressalis(4個)、煙草天蛾Manducasexta(4個)等(Allen and Wanner, 2011; Changetal., 2015; Vogtetal., 2015; Liuetal., 2017)。夜蛾科昆蟲一般表達3個PBPs，但本實驗從草地貪夜蛾中克隆了4個SfruPBPs基因，這與斜紋夜蛾中鑒定的PBPs基因數(shù)量一致(孫佳斌等, 2018)。雖然SfruPBP4與其它3個SfruPBPs蛋白的一致性均較低，且SfruPBP4蛋白序列的長度也顯著大于另外3個SfruPBPs，但仍然推測SfruPBP4屬于PBP家族，證據(jù)主要有(1)SfruPBP4的蛋白序列具有鱗翅目PBP的典型特征，即氨基端分泌信號肽和位置保守的6個半胱氨酸殘基；(2)在進化樹中SfruPBP4顯示出與其它鱗翅目昆蟲PBPs緊密的親緣關(guān)系；(3)SfruPBP4基因與SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在草地貪夜蛾基因組上呈串聯(lián)排列，并且均具有保守的內(nèi)含子插入位點。在家蠶、煙草天蛾、歐洲玉米螟和亞洲玉米螟基因組中，PBPs基因也均為串聯(lián)排列(Gongetal., 2009; Vogtetal., 2015; Yasukochietal., 2018)。草地貪夜蛾基因組中存在4個SfruPBPs很可能是源自進化中的基因加倍事件。

研究PBPs基因在不同組織中的表達模式有助于推測基因的功能。一般認為，在雄蛾觸角中表達量高而在雌蛾觸角中表達量低的PBPs基因可能會參與識別雌蛾釋放的性信息素(王菁楨等, 2017; 汪超等, 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3均大量表達于觸角，且SfruPBP1和SfruPBP2在雄蛾觸角中的表達量顯著高于雌蛾，暗示著它們可能參與性信息素的識別。SfruPBP3在雌雄蛾觸角中的表達量差異不顯著，推測其可能在識別植物揮發(fā)物中起作用。在其它昆蟲中，PBPs基因也是多表達于成蟲觸角，并能夠結(jié)合性信息素和植物揮發(fā)物等(Yuetal., 2018; Sunetal., 2019)。本研究還發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾SfruPBP4僅在雄蛾腹部表達。在其它鱗翅目昆蟲中，也發(fā)現(xiàn)一些PBPs表達于非嗅覺組織，例如煙草天蛾MsexPBP4僅表達于成蟲馬氏管(Vogtetal., 2015)，斜紋夜蛾SlituPBP4僅表達于雄成蟲生殖系統(tǒng)(孫佳斌等, 2018)。此外，針對SlituPBP4重組蛋白的熒光競爭結(jié)合實驗結(jié)果表明，該蛋白對多種性信息素和植物揮發(fā)物均沒有結(jié)合能力，推測該蛋白可能在嗅覺以外的生理過程中起作用(孫佳斌等, 2018)。本研究未對草地貪夜蛾SfruPBP4開展功能實驗，因此該基因在生理過程中的作用尚不明確。在下一步研究中，將綜合利用蛋白異源表達、熒光競爭結(jié)合和RNA干擾等技術(shù)，闡明SfruPBP4的生理功能。