高效液相色譜?電霧式檢測法測定甘草中4種有效成分的含量

任霞，胡沖，張亞中

作者單位：1安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230031；2安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051

甘草（Radix Glycyrrhizae）為豆科植物Glycyrrhiza uralensis Fisch.脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，是我國醫藥管理部門收載和管理的重要中藥材之一[1]。甘草也是臨床上應用最廣泛的傳統中藥，始載于東漢時期我國古代第一部藥學專著《神農本草經》，被列為上品，味甘、性平，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰、緩急止痛、調和諸藥的功效[2-3]。甘草中主要有效成分分為兩種，一為三萜類化合物，包括甘草酸、甘草次酸等。二為黃酮類化合物，包括芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素等。最初認為甘草的藥理作用均起因于甘草中三萜類成分，其主要藥理作用包括抗炎、抗過敏、保肝、抗癌等[4-9]。自被報道甘草抗潰瘍作用來源于甘草黃酮后，甘草中黃酮類成分才得到高度的關注，目前已經證實黃酮類成分存在抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素樣作用、降糖、降脂、解痙、抗抑郁等藥理作用[9-14]。

自2010版《中國藥典》后，甘草質量標準由控制三萜類化合物甘草酸單一成分，增加為三萜類化合物甘草酸和黃酮類化合物甘草苷兩種成分。但經HPLC檢測可知，色譜圖中有的峰型一般、基線不平穩，故嘗試高效液相色譜-電霧式檢測器（HPLCCAD）方法進行檢測[15]。HPLC-CAD具有較寬的動態檢測范圍、較高的靈敏度和重復性等優點，應用于中性、酸性、堿性及兩性物質等，特別是無紫外吸收、非揮發性或半揮發性物質的檢測[16-17]。

本研究自2017年6月至2019年6月，完成不同產地烏拉爾甘草的收集和用HPLC-CAD檢測方法對甘草藥材中4種成分的含量檢測，為甘草今后的質量標準制定提供有意義的參考。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000液相色譜儀（美國Dionex公司）配備Corona Ultra電霧式檢測器及Chromeleon 7.2色譜工作站，紫外檢測器（美國Dionex公司DAD），分析天平（Mettler Toledo XP26、Mettler Toledo AG285），超聲儀（Elmasonic S），Millipore Simplicity-185型超純水儀（美國Millipore公司）。Waters XBridge C 18色譜柱（填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠；4.6 mm×250 mm，5 μm）。

芹糖甘草苷對照品（上海詩丹德生物技術有限公司，生產批號6797，含量98%；）、甘草苷對照品（中國生物制品檢定研究院，生產批號111610-700604，含量100%；）、芹糖異甘草苷對照品（上海詩丹德生物技術有限公司，生產批號5063，含量98%；）及甘草酸對照品（中國食品藥品檢驗研究院，生產批號110731-201720，含量97.9%；）乙腈：質譜純；甲酸（99.5%）：色譜純；水：超純水；甘草樣品收集信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，A相維持在19%；8～35 min，A相由19%上升至50%；35～36 min，A相上升至100%；36～37 min，A相由100%下降至19%；37～47 min，A相維持在19%；），流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；電霧式檢測器：霧化溫度為40℃、氣源為N2、壓力4.156×105Pa。

表1 甘草樣品來源

2.2 對照品溶液的配制 取對照品芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸適量，精密稱定，加適量70%乙醇超聲溶解，冷卻后再用70%乙醇定容到刻度，最終得到各對照品濃度1分別為0.039 21、0.034 29、0.032 19和0.169 37 mg/mL。

取對照品芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸適量，精密稱定，加適量70%乙醇超聲溶解，冷卻后再用70%乙醇定容到刻度，最終得到各對照品濃度 2分別為 0.818 0、0.710 8、1.580 3和6.375 0 mg/mL。

2.3 線性關系的考察 精密量取“2.2”項下芹糖甘草苷對照品溶液1、甘草苷對照品溶液1、芹糖異甘草苷對照品溶液1和甘草酸對照品溶液1不同體積溶液，注入高效液相色譜儀，采用CAD進行分析。以質量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，最終得到4種成分線性回歸方程見表2。

表2 線性回歸方程

結果表明，4種成分的線性關系良好，相關系數均大于0.999 0。

2.4 供試品溶液的制備 取甘草藥材粉末（過三號篩）約0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇

100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5 精密度試驗 精密量取同一供試品溶液10 μL，連續進樣6次依法測定，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸各峰面積相對標準偏差（RSD）結果分別為1.95%、1.99%、2.05%和1.13%（n＝6），RSD＜3.0%，表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，于配制后0、3、6、12、24、36、48 h分別精密量取10 μL，注入液相色譜儀，采用CAD檢測器進行分析，測定芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸各峰面積RSD分別為1.12%、2.23%、1.89%和2.01%（n＝7），RSD＜3.0%，表明樣品在48 h內穩定。

2.7 重復性試驗 取甘草藥材粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，照“2.4”項下方法，共制備6份供試品溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，測定含量。結果甘草藥材中平均含量為2.05%、4.73%、0.80%和9.72%，4種成分含量結果的RSD分別為1.19%、1.78%、1.28%和1.89%（n＝6），RSD＜3.0%，表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 取甘草藥材約0.1 g各6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加芹糖甘草苷對照品溶液2（0.818 0 mg/mL）、甘草苷對照品溶液2（0.710 8 mg/mL）、芹糖異甘草苷對照品溶液2（1.580 3 mg/mL）和甘草酸對照品溶液2（6.375 0 mg/mL）各2.5、6.5、0.5、1.5 mL，平衡操作6次，加入相應量70%乙醇，使總溶液量為100 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。各取10 μL，注入液相色譜儀，測定含量，計算加樣回收率，結果見表3～6。

表3 芹糖甘草苷的回收率試驗結果

表4 甘草苷的回收率試驗結果

表5 芹糖異甘草苷的回收率試驗結果

表6 甘草酸的回收率試驗結果

2.9 供試品含量測定 取甘草藥材，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸的含量，結果見表7及圖1。

3 討論

3.1 檢測器的選擇 HPLC-CAD色譜圖基線較為平穩、峰型良好、分離度良好、靈敏度高，故選擇HPLC-CAD進行各成分的含量測定。CAD是一種新型通用性檢測器，不依賴于化合物的分子結構，對大多數化合物響應性一致，有著靈敏度高、低檢測限、重現性好、穩定性好等優點。

3.2 色譜條件的優化 CAD檢測器適用揮發性的有機酸，所以本試驗對有機酸進行了篩選，嘗試用乙腈-甲酸和乙腈-乙酸和乙腈-三氟乙酸流動相系統，其中以乙腈-甲酸流動相分離效果最佳，且基線較為平穩，經進一步優化后，確定了本試驗的乙腈-0.05%甲酸溶液作為流動相體系，各色譜峰分離效果良好，噪音小，系統較為穩定可行。

3.3 甘草含量測定結果的分析 用HPLC-CAD方法測定甘草藥材的含量結果是：芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸的含量分別在0.26%～2.27%、0.33%～5.07%、0.14%～0.81%、0.77%～9.76%范圍。根據2015版本《中國藥典》甘草含量測定項下限度要求：甘草苷不小于0.5%，甘草酸不小于2.0%，只有GC-007和GC-008批次甘草樣品含量不符合規定，其余均符合藥典要求。

此收集的甘草均為烏拉爾甘草，產地分別為新疆庫爾勒、新疆輪臺、內蒙古呼和浩特、內蒙古赤峰和甘肅蘭州。從不同成分進行分析，芹糖甘草苷成分：新疆兩個產地＞內蒙古兩產地＞甘肅蘭州；且新疆兩產地含量相近、內蒙古兩產地的含量也相近。甘草苷成分：新疆兩產地＜甘肅蘭州＜內蒙古兩產地；新疆兩產地含量相近，內蒙古兩產地含量相差較明顯，內蒙古赤峰產地中的甘草苷是其他產地的約3～5倍；芹糖異甘草苷成分：新疆兩產地＞內蒙古兩產地大于甘肅蘭州；且新疆兩產地含量相近，內蒙古兩產地也含量相近。甘草酸成分：明顯可以看出新疆和內蒙古兩產地的含量較高于甘肅蘭州。根據以上結論，可為選用不同產地甘草提供依據，如主要作用于抗炎、抗過敏、保肝、抗癌等[4-9]的，則可以選擇內蒙古和新疆產地的甘草藥材，尤其可以選擇內蒙古赤峰產地。如主要作用于抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素樣作用、降糖、降脂、解痙、抗抑郁等藥理作用[9-14]的，則可選擇新疆和內蒙古兩產地，尤其可以選擇內蒙古赤峰的。

本研究采用HPLC-CAD技術，對甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸4種成分進行含量測定，快速、準確，可為客觀評價甘草質量提供科學依據。

表7 甘草藥材中四種有效成分的含量測定結果

圖1 甘草藥材HPLC和CAD檢測器檢測試驗結果：A回收率試驗—供試品溶液色圖譜（CAD檢測器）；B供試品溶液色圖譜（CAD檢測器）；C供試品溶液色圖譜（HPLC-UV）；D混合對照品溶液色譜圖（CAD檢測器）