氫溴酸沃替西汀有關物質的測定方法

杜娟花，黃美容，曹陽，黃順旺，曹明成

作者單位：合肥創新醫藥技術有限公司，安徽 合肥230088

氫溴酸沃替西汀（VorticetineHydrobromide），也稱氫溴酸伏硫西汀，CAS：508233-74-7，化學名為1-[2-（2，4-甲基苯硫基）苯基]哌嗪氫溴酸鹽，被認為是一種新型多模型抗抑郁藥物[1]，是由日本武田制藥和丹麥靈北公司共同開發用于治療重度抑郁癥成人病人的藥物，體外研究表明，其具有可拮抗5-HT3、5-HT7及5-HT1D受體，激活5-HT1A受體，部分激活5-HT1B受體及抑制5-HT的轉運的功能[2]。是第一個具備多種藥效活性的抗抑郁藥物，該藥物尚無國產化。

我們從2013年4月開始研究氫溴酸沃替西汀。該藥物的合成由2，4-二甲基苯硫酚與鄰碘溴苯反應合成2-（2，4-二甲基苯基硫基）硫醚，再與哌嗪反應制備沃替西汀，之后成氫溴酸鹽，得到終產品[3-8]。制備過程中產生的雜質并經結構確證有雜質A～K。見圖1。

本研究測定氫溴酸沃替西汀的有關物質為外標法、主成分自身對照法，靈敏度好、準確度高，可作為原料質量控制的評價方法。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（島津公司，日本）；AG135電子分析天平（梅特勒托利多公司，瑞士）。

圖1 氫溴酸沃替西汀制備過程中的雜質結構圖

氫溴酸沃替西汀對照品（批號：20131201-J，含量：99.6%）、雜質A（批號20131101，純度97.2%）、雜質B（批號 20131102，純度 99.4%）、雜質C（批號20131103，純度97.3%）、雜質D（批號20131104，純度99.6%）、雜質E（批號20131106，純度99.2%）、雜質F（批號13-08-0137，純度99.2%）、雜質G（批號20131107，純度95.0%）、雜質H（批號20131105，純度98.8%）、雜質I（批號20131108，純度98.5%）、雜質J（批號20131109，純度93.3%）、雜質M（批號13-08-0138，純度95.1%）；氫溴酸沃替西汀原料藥（批號20150901～20150903、20160301～20160303），以上對照品中雜質F、M為SINCO PHARMACHEM提供，其余對照品及供試品均為合肥創新醫藥技術有限公司合成。乙腈、三乙胺為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備 對照品貯備液1：取雜質B、D、E、F、G、H、I、J、M對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋，制備成每1 mL含9個雜質各25 μg的混合溶液。

對照品貯備液2：取雜質B、D、E、F、G、H、I、J、M對照品與氫溴酸沃替西汀對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋，制備成每1 mL含氫溴酸沃替西汀與9個雜質各25 μg的混合溶液。

雜質對照品溶液：精密量取1 mL雜質對照品貯備液1，置50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取氫溴酸沃替西汀原料25 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

0.1 %對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度并搖勻；精密量取該稀釋液1 mL，置20 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度并搖勻，即得。

系統適用性溶液：精密量取1 mL對照品貯備液1，置50mL量瓶中，加入經精密稱定的25 mg氫溴酸沃替西汀原料，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2 色譜條件及系統適用性 色譜柱Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40℃；檢測波長226 nm；流速1.0mL/min；進樣量20 μL；流動相A：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH至6.0）-乙腈（90∶10），流動相B：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH值至6.0）-乙腈（10∶90），梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

稱取雜質A、B、C、D、E、F、G、H、J、M、I適量，制備各雜質的單標溶液，進行定位，再進注系統適用性溶液進行液相色譜分析。見圖2。

系統適用性溶液中各已知雜質均能與主成分達到較好分離，分離度均良好。

2.3 專屬性 取氫溴酸沃替西汀原料25 mg，置50 mL量瓶中，分別進行高溫、光照、氧化、酸、堿破壞，酸、堿破壞進行中和，再用乙腈溶解并稀釋定容，搖勻；并同法制備破壞空白。按“2.2”項下色譜條件進樣分析。結果表明，本品在強光及高溫條件下有少量降解雜質，強酸、強堿、強氧化時能產生明顯降解雜質。且主成分峰與相鄰雜質峰分離度能符合要求，破壞前后物料基本守恒，主峰純度符合要求。

圖2 系統適用性試驗色譜圖

2.4 定量限、檢測限、線性范圍與校正因子 精密量取對照品貯備液2，加乙腈稀釋成0.2～2.0 μg/mL不同濃度的系列對照品混合溶液，分別進樣，記錄色譜圖。以各成分的峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，并以回歸方程的斜率計算各已知雜質相對于氫溴酸沃替西汀的校正因子（RCF），同時測定各成分的定量限（LOQ）與檢測限（LOD），結果見表2。

表2 氫溴酸沃替西汀有關物質線性和RCF

2.5 精密度與準確度 精密度：按“2.1”項下方法由雙人各制備供試品6份，在“2.2”色譜條件下，以不同液相色譜儀進行測定，計算各雜質RSD。單人、6份樣品，總雜含量的RSD均＜7.5%，單個雜質含量的RSD均＜10%。雙人共12份樣品，總雜含量的RSD均＜10%，單個雜質含量RSD均＜15%。

精密量取雜質對照品貯備液1，加入供試品中，制成含各已知雜質為限度的50%、100%、150%的回收率樣品，進樣分析，記錄色譜圖，計算各雜質回收率。9個已知雜質B、D、E、F、G、H、I、J、M的平均加樣回收率在（100.2±1.1）%。

2.6 溶液穩定性 按“2.1”項下制備雜質對照品溶液與供試品溶液，25 ℃放置，并于0、2、4、8、12、24 h分別取樣進樣分析，記錄色譜圖。計算得雜質對照品溶液中單個雜質峰面積的RSD均＜4%，供試品溶液中，各雜質峰面積的RSD均＜15%，且無新雜質產生。

2.7 耐用性 通過分別調整色譜條件中的柱溫±2℃、檢測波長±2 nm及pH值±0.2，考察系統適用性溶液中雜質與主成分之間分離度的情況。結果表明，柱溫、流速及pH值等參數的調整對測定結果基本不會產生影響，方法的耐用性良好。

2.8 樣品測定 按上述已確定的色譜條件及方法，對氫溴酸沃替西汀原料6批進行有關物質測定，按外標法計算供試品溶液中已知雜質含量，自身對照法計算未知雜質含量。其中，雜質B～I均未檢出。其他雜質檢測見表3。

表3 氫溴酸沃替西汀有關物質檢測結果/%

3 討論

以乙腈為溶劑，分別配制氫溴酸沃替西汀和9個已知雜質（雜質B、D、E、F、G、H、I、J、M）的對照品溶液，在190～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，氫溴酸沃替西汀和雜質B、G、J）在226 nm處有最大吸收，雜質D、E、F、H、I、M在226 nm處均有較大吸收，故采用226 nm作為檢測波長。根據專利[9]中有關物質，流動相為甲醇：乙酸銨緩沖液的反相體系；為了改善各雜質的峰形，將流動相中緩沖系統定為磷酸-三乙胺緩沖體系，進行優化后確定梯度洗脫程序，各組分的峰形良好，分離度符合要求，故選擇該流動相體系。

國外藥典尚未收載氫溴酸沃替西汀原料或制劑標準，在已有文獻[10-14]報道的有關物質研究中，有HPLC法、液質聯用法、ESI-Q-TOF/MS、APCI-TOF/MS等方法，檢測的雜質數量2～7個，涉及的雜質含本研究中的雜質B、E、F、I、M。本研究中由于雜質A與雜質C分別是由起始原料2，4-二甲基苯硫酚中的2，5-二甲基苯硫酚與3，4-二甲基苯硫酚參與化學反應產生的副產物，且單標定位時雜質A、C與主峰的出峰位置相同，故可通過控制起始原料2，4-二甲基苯硫酚的產品質量來控制成品中雜質A、雜質C的含量；雜質G、J為鄰溴碘苯中雜質間溴碘苯、對溴碘苯分別參與反應生成的，與氫溴酸沃替西汀為苯環上位置異構雜質，分離難度較大；雜質D、H為鄰溴碘苯與哌嗪進行反應產生的雜質。本研究在液相色譜條件下氫溴酸沃替西汀、雜質G、雜質J依次出峰，與相鄰峰均能達到很好地分離。

已知雜質B、D、E、F、G、H、I、M的校正因子不在0.9～1.1范圍內，參照文獻[15]，建議將已知雜質訂入質量標準，按外標法計算、質控限度為0.1%；未知雜質按自身對照法、0.1%的限度進行控制。