五味子丙素緩解血管緊張素Ⅱ誘導的心臟炎性反應和心肌重構

談云，葉琳嵐，趙珺瑤，呂衛群

作者單位：無錫市第三人民醫院（江南大學附屬醫院）藥劑科，江蘇 無錫214041

生理和病理性心臟結構重塑通常與血流動力學、心室形狀和心肌力學的慢性改變有關，這些改變最初為了彌補心臟結構重塑而被觸發，但最終加重了心肌重構[1-3]。細胞介導的機械轉導反應對適應和非適應心肌與基質重塑起著重要調節作用[1]。機械負荷還可誘導血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、內皮素1和轉化生長因子β（TGF-β）等因子的釋放，這些因子是心肌細胞肥大和基質重塑的有效活化因子[4-6]。在器官和組織上，壓力超負荷和運動誘導的生理性肥大時的同心肥大可以通過正常化壁應力或增加心輸出量來達到穩態或代償[7]。這些肥厚反應也可能伴隨著細胞外基質（ECM）和冠狀動脈系統的適應性重塑[8]。五味子是一種常用的中藥，近年來臨床用于治療肝炎[9]，有研究報道五味子丙素可明顯緩解四氯化碳誘導的肝損傷[10]，但在心血管疾病中五味子丙素的作用尚不明確。2018年7月至2019年1月，本研究以小鼠為對象，研究五味子丙素對AngⅡ誘導小鼠心肌重構的影響調節，為臨床運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購自南京大學模式動物研究所[許可證號：SCXK（蘇）2018-0008]。

1.2 藥物與試劑 五味子丙素，購自美國selleck公司；逆轉錄試劑盒，實時定量PCR試劑盒，美國Invitrogen公司；血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒，美國eBioscience公司；RNA提取試劑，大連Takara公司。

1.3 主要儀器 倒置及正置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；SpectraMaxM2型酶標儀，Molecular Devices生物科技公司；蛋白電泳、轉膜與曝光系統，美國Bio-rad公司。

1.4 實驗動物 選擇8周齡的雄性C57BL/6小鼠24只，體質量為18～22 g，清潔級。在本研究中，24只C57BL/6小鼠被安置在一個12：12小時的光-暗循環中，在恒定的室溫下，用標準的嚙齒動物飼料喂養，并給予水。實驗前，動物至少在實驗室馴化2周。所有動物護理和實驗程序均按照《實驗室動物護理和使用指南》（美國國立衛生研究院）中概述的指令執行。經醫院動物倫理審查委員會同意，實驗用鼠均置于《實驗動物管理條例》規定的標準條件下。

1.5 心室重構實驗動物模型建立 皮下注射AngⅡ磷酸緩沖液（pH7.2）[0.5 mg·kg-1·（2d）-1，持續 8周]誘導10周大的C57BL/6小鼠心肌重構。將C57BL/6小鼠隨機分為三組，每組各8只，對照組單獨接受PBS的未經處理的C57BL/6對照小鼠；AngⅡ組為AngⅡ誘導的心肌重構小鼠；AngⅡ+ShC組為AngⅡ誘導的心肌重構小鼠，從AngⅡ注射前第1天開始口服五味子丙素（1%CMC-Na溶液），劑量為5 mg·kg-1·d-1，持續8周。PBS（磷酸緩沖鹽溶液）組和AngⅡ組小鼠單獨接受1%的CMC-NA溶液，時間與ShC治療組相同。動物在戊巴比妥鈉麻醉下被處死。小鼠死亡后，解剖心臟并稱重，比較心臟質量/體質量（hw/bw，mg/kg），將心臟組織置于液氮中快速冷凍，進行基因和蛋白表達分析。此外，在死亡時，用含肝素的針注射器從右心室采集血液。

1.6 生化指標測定 用相應的試劑盒（江蘇南京建成生物工程有限公司）檢測血液中的生化分子肌酸磷化脢-同功脢CK-MB。

1.7 實時定量聚合酶鏈式反應 心臟組織（20～50 mg）由Trizol（Invitrogen，Arlsbad，CA）中根據說明書提取RNA。cDNA是通過轉錄酶和隨機六聚體引物的作用下以mRNA為模版逆轉錄而成的。繼而，利用實時定量PCR分析檢測心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、肌球蛋白重鏈（MYHC）、IL-6、TNF-α、TGF-β、膠原IV（CollagenIV）和β-肌動蛋白（β-actin）mRNA的表達水平，引物序列見表1。

1.8 酶聯免疫吸附實驗測心臟中炎性因子的含量

TNF-α/IL-6水平檢測：研磨組織并用蛋白裂解液提取，而后檢測蛋白濃度。將TNF-α/IL-6的捕獲抗體包被至96孔ELISA板，過夜放置于4℃。第2天，PBST（0.1‰Twen-20的PBS）洗滌3次，每次均置于吸水紙上將剩余液體拍干，后向已包被的ELISA板加入BSA封閉，1 h后棄BSA并將細胞培養上清液加入至ELISA板中，于室溫搖床放置2 h。隨后PBST洗滌3次，將TNF-α/IL-6的檢測抗體加入至ELISA板，于室溫搖床放置1 h。隨后PBST洗滌3次，將Strapavaidin-HRP加入至ELISA板，于室溫搖床放置30 min。隨后將HRP顯色底物（TMB）加入至ELISA板，于室溫避光放置15 min，而后將終止緩沖液（4%硫酸）加入至ELISA板，利用酶標檢測儀，設置參數為450 nm，測定吸光度

表1 實時定量聚合酶鏈式反應的引物序列

1.9 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，所有計量資料以表示。兩組間的比較采用Student's t檢驗分析，多組間的差異比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正作后比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五味子丙素顯著減輕AngⅡ誘導的體內心臟損傷 每組8只小鼠，分別每兩天皮下注射注射0.5 mg/kg的AngⅡ誘導小鼠心臟損傷。在小鼠死亡后，我們檢測了血清CK-MB水平。PBS組為（120.9±18.95）μmol/L，AngII組為（198.0±36.43）μmol/L，AngII+ShC組為（113.5±39.47）μmol/L，三組間CK-MB水平比較，F＝12.57，P＝0.000 5；AngⅡ誘導CK-MB水平升高，五味子丙素處理顯著降低。

2.2 給予五味子丙素可顯著減輕AngⅡ誘導的心肌重構 圖1A顯示皮下注射AngⅡ可誘導小鼠心重比升高，而五味子丙素處理可得到緩解[AngⅡ組比AngⅡ+ShC 組為（6.32±0.99）‰比（4.93±0.17）‰，P＜0.05]，并且AngⅡ注射液和五味子丙素治療均不影響實驗小鼠的體質量變化（圖1B）。五味子丙素處理抑制了AngⅡ誘導的心功能相關基因ANP[（3.37±0.60）比（1.41±0.37）倍，P＜0.05]、BNP[（2.51±0.75）比（0.78±0.55）倍，P＜0.05]、促肥大基因 MYHC[（2.57±0.74）比（1.18±0.26）倍，P＜0.05]的mRNA過度表達（圖1C）。此外，AngⅡ組比AngⅡ+ShC組分別 為（3.70±1.47）比（1.68±0.56）倍 、（5.25±0.94）比（1.78±0.57）倍（P＜0.05），見圖1C，并且發現AngⅡ可升高小鼠血壓，但五味子丙素治療卻不改善血壓的升高，AngⅡ組比AngⅡ+ShC組為（132.50±8.86）比（133.10±12.16）mmHg，差異無統計學意義（圖1D）。

2.3 五味子丙素可顯著抑制AngⅡ誘導的小鼠心臟炎癥 實時qPCR分析顯示，與對照組相比，AngⅡ組小鼠的TNF-α和IL-6的mRNA表達顯著增加，而五味子丙素處理后，這些因子表達的增加被明顯抑制，AngⅡ組比AngⅡ+ShC組分別為（7.18±2.85）比（2.92±0.86）倍，（12.89±5.40）比（4.29±3.43）倍，P＜0.05）（圖2A）。通過ELIAS檢測心臟中TNF-α和IL-6的蛋白水平，結果顯示AngⅡ組小鼠的TNF-α和IL-6的蛋白水平顯著升高，而服用五味子丙素可顯著降低這些升高[AngⅡ組比AngⅡ+ShC組分別為（4.80±0.78）比（2.09±0.41）ng/mg，（2.56±0.73）比（1.23±0.41）ng/mg，P＜0.05]（圖2B）。

圖1 五味子丙素顯著減輕Ang II誘導的心肌重構：A為小鼠心臟質量體重量比，B為小鼠體質量變化，C為小鼠心臟ANP、BNP、MYHC、Collagen IV、TGF-β的mRNA水平變化，D為小鼠血壓變化

圖2 五味子丙素可顯著抑制AngⅡ誘導的小鼠心臟炎癥：A為小鼠心臟IL-6和TNF-α的mRNA水平，B為小鼠心臟IL-6和TNF-α的蛋白水平

3 討論

心力衰竭是大多數心血管疾病病人最主要的死亡原因，病人的醫療費用也是社會沉重經濟負擔的重要組成部分[11-13]。在心力衰竭的病理發展過程中，心肌重構起著至關重要的作用[14]。心肌重構是心臟的一種適應性反應，發生在各種外在和內在刺激中，這些刺激會增加生物力學壓力[12]。因此，了解心肌重構的機制和潛在靶點對心血管生物學領域很重要，并可能成為預防或治療心血管疾病的新策略。臨床和實驗研究表明，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的主要效應物，在導致心肌重塑的生物學過程中具有重要作用[1，15]。除了其在動脈血壓調節中的生理作用（即通過血管收縮和鈉水滯留），AngⅡ還通過激活心臟炎癥直接誘導心肌重構[16-17]。許多研究支持AngⅡ對心肌細胞有著直接影響，包括心肌細胞炎癥、肥大、纖維化和細胞外基質的積累[7，16，18]。在我們的研究中發現五味子丙素可在不改變小鼠體質量（圖1B）以及AngⅡ誘導的血壓升高（圖1D）條件下，改善AngⅡ引起的心重比升高（圖1A）。除此之外，心功能相關指標ANP和BNP的mRNA水平在AngⅡ誘導下顯著升高，表明AngⅡ引起心功能紊亂；然而，五味子丙素治療后，AngⅡ誘導的ANP和BNP明顯下調（圖1C）。膠原生成增多是心肌重構中的重要一環，我們研究發現，皮下注射AngⅡ后，Collagen IV和TGF-β顯著上升，而五味子丙素可逆轉這些變化（圖1C）。以上表明五味子丙素可改善AngⅡ誘導的心肌重構。

AngⅡ誘導的心肌炎癥是心肌重塑和心力衰竭的關鍵因素之一[16-17，19]。文獻報道阻斷TLR4（經典炎癥信號通路的上游蛋白）可減輕AngⅡ誘導的心肌炎癥，并改善高血壓引起的心臟功能紊亂[20]。Echem等人發現，局部炎性反應（如促炎細胞因子IL-1β和TNF-α的增加）在高血壓相關的心肌重構中起著關鍵作用，而TLR4依賴的免疫抑制可緩解心肌纖維化和肥大，且血壓水平無變化[21]。除此之外，Matsuda等[22]證明以TLR4缺陷小鼠為實驗模型，TLR4缺乏逆轉了AngⅡ誘導的心臟肥大、單核細胞/巨噬細胞浸潤和舒張功能障礙，且血壓水平無變化。因此，除了經典的AT1受體和高血壓，炎癥反應被認為是連接AngⅡ與心臟疾病的一個紐帶。本研究發現AngⅡ可誘導心臟組織中炎性因子（TNF-α和IL-6）的過度表達，而五味子丙素治療可顯著緩解（圖2）。因此我們推測五味子改善AngⅡ誘導的心室重構可能源于其抗炎作用。但并未進一步深入探索，此為本研究的局限。

綜上所述，本研究發現五味子丙素能有效抑制AngⅡ誘導小鼠的心肌重構，并伴隨炎性反應的降低，表明五味子丙素可能成為治療心肌重構的候選藥物。