鉬酸鈉和抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗氮代謝關鍵酶與15N吸收利用的影響

劉利，韓真，李勃，陶吉寒

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

鉬（Mo）是植物正常生長發育不可或缺的一種微量元素［1，2］。Mo的化合價從0到+6價皆有［2］，在底物和輔酶因子（如鐵硫簇、血紅素和黃素類等）之間起電子傳遞的作用。植物主要從土壤中吸收+6價的鉬酸根（MoO2-4）以滿足正常生長發育所需［2］。鉬單獨存在于植物體內并不具有生物活性，而是以鉬酶的形式參與到體內的氧化還原反應過程中［1，3-5］。植物中的鉬酶有5種，分別是硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，NR）、黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，XDH）、醛氧化酶（aldehyde oxidase，AO）、亞硫酸鹽氧化酶（sulfite oxidase，SO）和線粒體氨肟還原蛋白（mitochondrial amidoxime reducing component，mARC）［6-8］。植物通過這些鉬酶參與到氮、碳、嘌呤、激素和硫的代謝過程中，鉬在植物的氮代謝過程中發揮著重要作用，參與到氮素固定、氮素還原和氮素同化過程中［3］。鉬缺乏可能導致植物中硝酸鹽積累，進而影響植物的正常生長發育。

世界上很多地方土壤中的有效Mo含量不能滿足植物正常生長發育所需，對于酸性土壤這一現象尤其嚴重［9］。在我國有大約4 400多萬公頃耕地缺Mo［10］，生長在有效Mo含量低的酸性黃棕壤上的冬小麥等作物出現了嚴重的缺Mo癥狀［11］。Mo缺乏的癥狀有鉬酶活性降低、氮饑餓反應、莖和葉發育受阻、葉枯斑病、種子發育不良、坐果率降低等［2，9，12］。研究發現，鉬可以提高水稻、小麥和煙草的硝酸還原酶活性，促進氮代謝，從而得出施鉬可以提高氮素利用率［13-15］。我們前期研究發現，葉面噴施合適濃度的鉬酸鈉可以提高葉片和根系的硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性，然后用Ca（15NO3）2同位素示蹤法直接證明了合適濃度的鉬提高了草莓植株的15N利用率［16］。為了進一步研究鉬酸鈉對草莓氮代謝的影響，本試驗中我們使用鉬酸鈉和鉬的抑制劑鎢酸鈉研究其對幼苗生長發育和氮代謝關鍵酶活性以及15N吸收及利用的影響，以期為草莓生產上合理施用氮肥和鉬肥提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2019年10—12月在濟南市歷城區董家草莓試驗站日光溫室內進行。草莓供試品種為‘章 姬’（Fragaria ananassa Duch.cv.‘Akihime’）。選取生長勢一致的幼苗定植于栽培槽中，每個槽內定植2行，株距15 cm左右，共定植8棵，每個處理24棵。利用改良后的不含鉬元素的霍格蘭營養液培養，每隔2 d換一次營養液。試驗所有溶液均用蒸餾水配制。待幼苗長到10～15片真葉時，選取生長一致的幼苗用蒸餾水進行饑餓處理7 d，然后進行試驗處理。

試驗分為3個處理：①CK（-Na2MoO4-Na2WO4），②Mo處理（+2.4 mmol·L-1+2.4 mmol·L-1Na2MoO460 mL），③W 處理（+2.4 mmol·L-1Na2MoO460 mL+2.4 mmol·L-1Na2WO460 mL）。Mo和W 處理每隔7 d噴施一次，一共噴施3次。然后分別用含Ca（15NO3）2（上海化工研究院生產，豐度為10.20%）但不含鉬的全硝態氮霍格蘭營養液培養。每個處理設置3個生物學重復，45 d后取樣測定植株鉬含量、氮代謝關鍵酶活性和15N的分配、吸收及利用。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 植株鉬含量 參照Wang等［17］的方法進行測定。稱取草莓植株干樣0.3 g于消解管中，加入5 mL優級純濃硝酸浸泡過夜后，再加入2 mL優級純雙氧水，采用微波消解萃取儀進行消解，消解完全冷卻后轉移至比色管中，用超純水定容至50 mL，放置過夜即可得樣品待測液；同時采用相同消解方法制備空白對照。用NexION 300X型電感耦合等離子體質譜儀測定。

1.2.2 根系活力 采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法［18］測定。TTC可以被植物的根系還原，其還原量表示脫氫酶活性，作為根系活力的指標。

1.2.3 葉綠素含量 利用分光光度法［18］測定。取新鮮的草莓葉片，清洗干凈，剪碎；稱取3份0.2 g剪碎的葉片分別放入研缽中研成勻漿，研磨時加入少量石英砂和碳酸鈣粉及3 mL 96%乙醇，研磨至變白，放置4 min左右過濾到25 mL棕色容量瓶中，反復沖洗干凈研缽，沖洗過濾液均合并至容量瓶中，定容搖勻；以96%乙醇作空白，在波長665、649、470 nm 下測定吸光度，根據公式（Ca＝13.95D665-6.88D649，Cb＝24.96D649-7.32D665，CT＝Ca+Cb）分別計算葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量CT的含量。

1.2.4 硝酸還原酶（NR）活性 采用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可以由產生的亞硝態氮的量表示。將草莓幼苗的根、莖和葉片清洗干凈后，每個樣品稱取1.0 g，放在研缽里研磨，參照Pinto等［19］的方法用6 mL提取緩沖液提取，4℃、8 000×g離心5 min，將上清液轉入試管中并編號，于540 nm測定吸光度，以每克鮮樣每小時產生的亞硝態氮含量（μg·g-1FW·h-1）表示NR活性。

1.2.5 亞硝酸還原酶（NiR）活性 參照Rao等［20］及Ozawa和Kawahigashi［21］的方法測定。取0.5 g新鮮的草莓組織樣品（地上部和地下部），剪碎放入預冷的研缽中，加入5 mL提取液充分研磨，紗布過濾，收集勻漿液離心獲得上清液即粗酶液。反應混合液包含0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.5）1 mL，10 mmol·L-1KNO20.05 mL，15 mg·mL-1甲基紫晶0.05 mL，粗酶液0.2 mL和50 mg·mL-1溶解在100 mmol·L-1NaHCO3的連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）。此混合液在25℃下保溫半小時直至甲基紫晶的顏色消失。反應剩余的的量用下述方法測定：上述反應剩余液0.2 mL，水6.5 mL，10%（w/v）磺胺（溶于濃HCl中）1.8 mL，1%（w/v）萘乙二胺1.5 mL。搖勻后在30℃下黑暗保溫30 min，然后在540 nm波長下比色。

1.2.6 谷氨酰胺合成酶（GS）活性 參照趙世杰等［18］的方法測定。

1.2.7 谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）活性 參照Singh和Srivastava［22］的方法測定。以每分鐘每毫克反應混合液于30℃減少1μmol NADH為一個酶活單位。

1.2.815N利用率 將植株分成根部和地上部，放入烘箱中于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱重，研磨粉碎后過0.25 mm篩，裝袋備用。植株全氮用凱氏定氮法測定［23］，15N豐度在中國農業科學院原子能利用研究所用MAT-251質譜儀（美國菲尼根公司）測定。

15N利用率（%）＝器官15N吸收量（g）/施肥量（g）×100；

器官15N吸收量（g）＝Ndff×器官全氮量（g）；

Ndff（%）＝［植物樣品中15N豐度（%）-15N自然豐度（%）］/［肥料中15N豐度（%）-15N自然豐度（%）］×100；

氮肥分配率（%）＝各器官從氮肥中吸收的氮量（g）/總吸收氮量（g）×100；

器官全氮量（g）＝器官生物量（g）×氮含量（%）。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，LSD法進行差異顯著性檢驗，應用Microsoft Excel 2003繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗Mo濃度的影響

由圖1可知，Mo處理的幼苗根部和地上部Mo濃度均最高，顯著高于CK和W 處理，其中根部的Mo濃度顯著高于地上部；W 處理地上部和根部的Mo濃度與CK無顯著差異。

圖1 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上、地下部鉬濃度的影響

2.2 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗根系活力和葉綠素含量的影響

根系活力的高低直接影響植物對礦質元素的吸收和地上部的生長。由圖2和圖3可以看出，Mo處理的幼苗根系活力和葉綠素含量最高，顯著高于其它處理；W 處理的幼苗根系活力和葉綠素含量低于CK，其中葉綠素含量顯著低于CK。表明培養基中加入鉬酸鈉有利于促進草莓幼苗的生長。

2.3 鉬酸鈉及其抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗氮代謝關鍵酶活性的影響

Mo處理顯著提高草莓幼苗地上部和根部NR、NiR、GS和NADH-GOGAT活性，而W 處理則降低其地上部和根部NR、NiR、GS和NADHGOGAT活性，而且根部NR、NiR 和NADHGOGAT活性的降幅達顯著水平（圖4—圖7）。表明培養基中加入鉬酸鈉有利于硝態氮的同化作用，而加入抑制劑鎢酸鈉后，由于鎢取代了鉬，使得硝酸還原酶活性降低，硝態氮的同化作用受到抑制。

圖2 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗根系活力的影響

圖3 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗葉綠素含量的影響

圖4 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（A1）和根部（A2）NR活性的影響

圖5 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（B1）和根部（B2）NiR活性的影響

圖6 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（C1）和根部（C2）GS活性的影響

2.4 鉬酸鈉及其抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗15 N利用率的影響

同位素15N-Ca（NO3）2標記表明，Mo處理的草莓幼苗15N利用率顯著高于其它處理，而W 處理幼苗中15N利用率顯著降低（圖8）。

圖7 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（D1）和根部（D2）NADH-GOGAT活性的影響

圖8 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗15 N利用率的影響

3 討論與結論

Mo是NR的活性成分，參與硝態氮還原為亞硝態氮的電子轉移過程［2］；鎢與Mo的性質相似，能夠直接取代Moco（molybdenum cofactor）中的Mo，從而抑制NR活性，影響氮代謝過程［24］。葉面噴施鉬酸鈉能夠提高草莓幼苗的氮同化能力，進而碳同化的能力也得到加強，發揮以氮增碳的作用，使得草莓幼苗長勢較好，葉片為正常綠色。對培養基中加入抑制劑鎢酸鈉進行驗證，發現只加鎢酸鈉的培養基上的幼苗株型變小，長勢減弱，部分葉片表現為黃色，出現與氮素缺乏類似的癥狀。對植株體內的Mo濃度檢測發現，施入鉬酸鈉幼苗的Mo濃度顯著高于其它處理，這說明培養基中的鉬參與到硝酸還原酶的合成過程，從而在植株的氮代謝過程中發揮作用。加入抑制劑的幼苗中Mo濃度和對照差異不大，這表明由于抑制劑的存在，培養基中加入的鉬酸鈉不能轉運到植株體內，檢測的Mo濃度基本上是植株體內初始Mo濃度。以上結果表明，缺Mo可能引起草莓幼苗根系和葉片結構發生異常，導致營養物質的合成及運輸發生紊亂，從而影響草莓幼苗的氮代謝和碳代謝過程。

本試驗結果表明，加入鉬酸鈉的幼苗NR活性最高，加入抑制劑鎢酸鈉的NR活性顯著降低，其它氮代謝關鍵酶（NiR、GS和NADH-GOGAT）表現出類似的趨勢。加入鉬酸鈉處理的幼苗15N利用率最高，而加入抑制劑的幼苗15N利用率較低。表明鉬酸鈉的加入使得植株體內Mo元素達到一種穩態平衡，有利于硝酸鹽的吸收還原，促進氮素的同化。綜上所述，葉面噴施2.4 mmol·L-1Na2MoO4有利于草莓幼苗生長，提高其氮代謝水平和15N吸收利用，而噴施抑制劑Na2WO4則會抑制其作用。