CALUX生物檢測法測定垃圾焚燒廠周邊農(nóng)田土壤中的二噁英類

張會強,白 昭,王 斐,張秦銘,馬文鵬,王雨薇

(1.陜西省環(huán)境監(jiān)測中心站，陜西 西安 710054；2.國家環(huán)境二噁英監(jiān)測西北分中心，陜西 西安 710054)

1 引言

二噁英類物質(zhì)包括多氯二苯并二噁英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)，共計210種化合物。這類化合物通過進入動物細胞內(nèi)與芳香烴受體(AhR)結(jié)合，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)各種的毒性效應(yīng)[1,2]，包括致癌、致畸、致突變和生殖毒性效應(yīng)[3～6]。隨著工業(yè)社會的發(fā)展，鋼鐵冶煉、垃圾焚燒、水泥生產(chǎn)、制漿造紙等行業(yè)排放產(chǎn)生的二噁英[7]，蓄積在土壤、底泥等環(huán)境介質(zhì)當中，因其極難降解，隨食物鏈放大并富集在動物和人體當中，影響食品安全和人體健康[8～10]。

2016年5月28日國務(wù)院印發(fā)了《土壤污染防治行動計劃》，簡稱“土十條”，旨在加強土壤污染防治，保證土壤環(huán)境質(zhì)量，保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。土壤中的二噁英類的定量檢測主要依據(jù)HJ 77.4-2008《土壤和沉積物二噁英的測定同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法》(high resolution gas-high resolution mass spectrometer ，簡稱 HRGC-HRMS法)。該方法檢測過程繁瑣，成本高，周期長，需有昂貴的高分辨質(zhì)譜檢測，不適用于環(huán)境樣品的大量篩選。熒光素酶報告基因法(the chemical-activated luciferase expression,以下簡稱CALUX法)是將熒光素酶作為報告基因插入到控制轉(zhuǎn)錄的DRE基因下游，制備成報告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染大鼠肝癌細胞構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。含二噁英類的樣品與細胞株共同孵育時，就會激活A(yù)hR信號通路，進而激活含DRD(dioxin responsive domain, DRD)報告基因的啟動子，誘導熒光素酶的表達，加入熒光素酶底物產(chǎn)生熒光，熒光值與二噁英含量成正比[11]。CALUX法已經(jīng)成為行業(yè)內(nèi)二噁英快速篩選的“熱點”方法[12～14]。

對某生活垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤進行了布點采樣(1#～9#樣品，詳見圖1)，采用快速溶劑萃取(ASE)進行樣品提取，硫酸酸洗和多層硅膠柱凈化，溶劑轉(zhuǎn)換為二甲基亞砜(DMSO)后，利用CALUX法測定了土壤樣品中的二噁英類。

2 實驗部分

2.1 主要儀器與試劑耗材

(1)主要儀器設(shè)備,如表1所示。

(2)試劑與耗材。正己烷、二氯甲烷，色譜純，均為Fisher品牌；甲苯、濃硫酸、濃鹽酸，色譜純，均為德國merck品牌；無水硫酸鈉、氯化鈉、硅藻土、優(yōu)級純，均為德國merck品牌；酸性硅膠柱、堿性硅膠柱、活性炭柱均為FMS品牌；CALUX細胞株和CALUX-Aid軟件由美國XDSI公司授權(quán)使用；胎牛血清(FBS)、細胞培養(yǎng)用抗生素(Pen Strep簡稱P/S)、胰蛋白酶(Trypsin)、培養(yǎng)基(RPMI-1640)均為Gibco品牌；二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma品牌；細胞裂解液、熒光素酶試劑盒均為Promega品牌；2,3,7,8-TCDD(50μg·mL-1，DMSO溶劑)為Wellington品牌；30～300 μL八通道移液器，1-100 mL大容量電動移液器購自德國Sartorius品牌；XB-K-25型細胞計數(shù)板，購自上海求精生化試劑儀器有限公司；Mr.Frosty梯度降溫盒，Nunc 96孔底透微孔板，均購自美國ThermoFisher公司；2 mL凍存管，50 mL離心管，10 cm細胞培養(yǎng)皿均購自美國Corning公司；其它玻璃器皿為實驗室常用規(guī)格。

圖1 某垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤采樣布點

表1 主要儀器設(shè)備相關(guān)信息

2.2 實驗步驟

2.2.1 樣品的預(yù)處理 稱取5.000g土壤樣品經(jīng)酸泡，過濾后，進行快速溶劑萃取，儀器條件：加熱溫度120℃，加熱時間6 min，靜態(tài)時間7 min，循環(huán)3次，清洗體積70%，吹氣時間200 s。提取液經(jīng)3次酸洗后用飽和氯化鈉溶液水洗，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約5 mL。經(jīng)多層硅膠柱(酸性硅膠柱+堿性硅膠柱+活性炭柱)凈化后，用正己烷定容至10 mL，分取5 mL轉(zhuǎn)移到K-D管濃縮到1.0 mL,氮吹吹干，用200 μLDMSO定容，室溫避光保存。

2.2.2 細胞實驗 按照91% (RPMI-1640)+8%FBS+1%P/S的比例配制培養(yǎng)基。從-80℃超低溫冰箱取出含CALUX細胞株的凍存管， 37℃恒溫水浴快速解凍，吹打散后快速轉(zhuǎn)入10 cm細胞培養(yǎng)皿進行細胞復(fù)蘇。37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)至長滿90%培養(yǎng)皿后再進行細胞傳代。將重復(fù)傳代的細胞溶液1 000 rpm離心3 min后，加入培養(yǎng)基重懸。細胞計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞密度為7.5×105cells·mL-1，此溶液為細胞種板溶液。按照每孔200 μL的細胞混懸液的量接種96孔板，每個孔接種15萬個細胞，接種方式按照圖2進行。然后將接種好的底透板做好標記后進行培養(yǎng)。

將50μg·mL-12,3,7,8-TCDD用DMSO進行逐級稀釋，配制成下表2濃度值。對培養(yǎng)了14～24 h的96孔板進行細胞給藥，然后置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出底透板，進行細胞裂解，于化學發(fā)光讀扳機上進行上機檢測，讀取熒光響應(yīng)值(RLU)。

圖2 細胞種板布板方式

(備注：PBS表示磷酸鹽緩沖溶液；NC表示DMSO溶劑空白；STD1～STD9表示標準系列；QC表示質(zhì)控樣；1#～9#表示樣品。)

表2 標準曲線濃度

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 標準曲線結(jié)果 將上機檢測讀取標準物質(zhì)的RLU值代入CALUX-Aid軟件，得出圖3熒光值對2,3,7,8-TCDD標準溶液的響應(yīng)曲線。

圖3 標準物質(zhì)的熒光響應(yīng)曲線

2.3.2 實驗結(jié)果 將上機檢測讀取樣品的RLU值代入CALUX-Aid軟件，得出1#～9#農(nóng)田土壤樣品中的二噁英毒性當量濃度分別為7.05 ngTEQ·kg-1、7.95 ngTEQ·kg-1、6.20 ngTEQ·kg-1、14.16 ngTEQ·kg-1、8.42 ngTEQ·kg-1、4.06 ngTEQ·kg-1、7.07 ngTEQ·kg-1、4.93 ngTEQ·kg-1、3.50 ngTEQ·kg-1。NC樣品未檢出，QC結(jié)果在合格范圍內(nèi)。

2.3.3 結(jié)果討論 9個樣品均為某生活垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤，二噁英毒性當量濃度范圍為3.50～14.16 ngTEQ·kg-1。均值為7.04 ngTEQ·kg-1低于荷蘭和瑞士的農(nóng)田土壤標準(10ngTEQ·kg-1)[15]。由圖4可見點位與排放口的距離越遠，二噁英濃度越低。該廠所處地理位置常年主導方向為南風，其中4#、5#和7#均位于該廠北面，因此，濃度值略高，其中4#超出了10 ngTEQ·kg-1的農(nóng)田土壤標準限值。

圖4 二噁英毒性當量濃度與采樣點位距煙囪直線距離的關(guān)系

3 結(jié)論

與HRGC-HRMS法相比，CALUX法檢驗結(jié)果僅能指示2,3,7,8-TCDD的毒性當量值，并不能給出樣品中二噁英組分的單體指紋特征及豐度，只能作為二噁英類快速篩選的半定量方法。但是，CALUX法利用哺乳動物細胞對二噁英進行暴露試驗，檢驗結(jié)果直接反映人體健康風險，同時可以實現(xiàn)對大量樣品的高通量檢驗，因此，CALUX法在實際應(yīng)用中具有獨特的優(yōu)勢和意義。