右旋糖酐水解改善右旋糖酐分子量分布的研究

慕 娟，問清江，鄭巧霞，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)具有增加血容量、改善微循環、防止彌散性血管內凝血的作用，主要用于治療失血性休克，是目前公認的優良血漿代用品之一，是美國FDA最早批準使用的多糖藥品。臨床上應用的常有3種規格產品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐的生產原理為：蔗糖經腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)產生的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase；E.C.2.4.1.5)合成右旋糖酐(粗酐)，粗酐進一步水解、分離純化為藥品右旋糖酐[1～2]。我國現有的右旋糖酐生產工藝中，右旋糖酐的水解采用鹽酸水解，由于鹽酸水解缺乏專一性，出現粗酐中的殘留蔗糖與右旋糖酐競爭水解，隨機性強，反應過程難控制，右旋糖酐分子量分布不集中，水解穩定性差，產品分子量分布受到極大的影響。從右旋糖酐40的分子量分布來看，我國的產品標準低于歐美國家(表1)，不僅分子量的分布不集中，而且重均分子量下移；實際產品質量往往只能達到重均分子量的下限，否則就難以滿足10%大分子≤120 000，10%小分子≥5 000。在右旋糖酐40制備工藝改進研究中發現，當發酵水平低下時，其他工藝條件不變的情況下，粗酐的鹽酸水解結果異常，還原糖變化增加較大，但水解產物的重均分子量卻沒有相應的降低，反而高于發酵水平高，酸解還原糖變化小的水解產物的重均分子量。分析原因，粗酐中的殘留蔗糖與右旋糖酐產生競爭水解，因此需要進一步研究。

表1 不同國家右旋糖酐40分子量分布[3～5]

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)能夠催化水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶水解右旋糖酐，具有專一性和高效性，可以提高水解效率；酶的底物特異性顯示酶的親和力隨底物分子量的增加而增強，尤其是對分子量1000萬以上的右旋糖酐的親和力遠遠大于100萬以下的右旋糖酐，這一特點有益于改善水解物的分子量分布[6]。筆者主要對蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭、鹽酸底物特異性等右旋糖酐酸解機理進行研究，同時進行右旋糖酐在酶解時是否有蔗糖競爭存在，右旋糖酐酶解條件等研究，最終實現改善右旋糖酐產品分子量分布的目標。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司產品；蔗糖(AR)，3,5-二硝基水楊酸(CP)；濃鹽酸(AR)；其他試劑為市售分析純。

1.1.2 右旋糖酐酶 (寧夏夏圣實業集團有限公司)。

1.1.3 右旋糖酐 (陜西省微生物研究所自制)。

1.1.4 儀器 722分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；85-2數顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)；101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)； 2010A-HT高效液相色譜儀(蘇州貝銳儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性 取0.5 mL的0.3% HCl溶液加入到0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液中，95℃準確反應10 min，加入2 mL DNS終止反應，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液95℃準確保溫10 min，先后加入2 mL DNS和0.5 mL 0.3% HCl溶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差根據葡萄糖標準曲線的回歸方程得出反應液中的葡萄糖量，從而確定還原糖的變化。

1.2.2 右旋糖酐酶的專一性 將右旋糖酐酶用一定pH值的緩沖液適當稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液中，50℃準確反應10 min，加入2 mL DNS終止反應，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液50℃準確保溫10 min，先后加入2 mL DNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差進行比較，以確定右旋糖酐酶的專一性。

1.2.3 不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性 分別以重均分子量T-10、T-40、T-70、T-500、T-1000、T-10000的右旋糖酐作為水解底物，按照1.2.1進行鹽酸水解，測定還原糖的量確定還原糖的變化。

1.2.4 不同水解方法制備右旋糖酐40 主要有:

1.2.4.1 鹽酸水解右旋糖酐制備右旋糖酐40。在鹽酸濃度0.8%，粗酐6.0%，溫度95℃，水解時間3.0 h條件下酸解右旋糖酐，水解結束加入1.0%的活性炭脫色40 min，抽濾收集濾液，乙醇分離純化，沉淀75%乙醇洗滌，干燥粉碎為右旋糖酐40。

1.2.4.2 右旋糖酐酶酶解右旋糖酐制備右旋糖酐40。右旋糖酐酶在粗酐6.0%，酶濃度0.1 IU·mL-1，時間3.5 h，溫度50℃條件下酶解右旋糖酐，酶解結束立即升溫至95℃滅活，同時加入活性炭脫色(95℃保溫30 min)，其余同1.2.4.1。

1.2.5 還原糖測定(以葡萄糖糖計)[6～7]采用DNS法測定葡萄糖糖。葡萄糖糖標準曲線繪制：配制1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，分別量取0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL葡萄糖標準溶液，用蒸餾水補齊1.0 mL，再加入2.0 mL DNS，沸水浴2 min，冷水浴水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm進行光吸收測定，繪制葡萄糖糖標準曲線，得出回歸方程用于葡萄糖的測定。

酶解液等樣品稀釋一定倍數，取樣品1.0 mL加入2.0 mL DNS煮沸2 min顯色，然后冷水浴冷卻至室溫，定容至10.0 mL，以蒸餾水為對照，540 nm測定吸光值，根據回歸方程得出樣品中的葡萄糖糖含量。

1.2.6 分子量與分子量分布[3]取樣品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取4～5個已知分子量的右旋糖酐對照品，依法檢查(2015版《藥典》二部附錄VH)，樣品10%大分子部分重均分子量不得大于120 000，10%小分子部分重均分子量不得小于5 000。

2 結果與分析

2.1 蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性

右旋糖酐和蔗糖在鹽酸濃度0.15%，溫度95℃等相同條件下水解，測定水解液中的還原糖，結果見圖1。蔗糖水解為果糖和葡萄糖，右旋糖酐斷開一個糖苷鍵可以產生一個還原端，因此在水解一個糖苷鍵時，前者的還原糖是后者的兩倍。從圖1可以看出，蔗糖的水解結果遠遠高于右旋糖酐，前者是后者的17倍，考慮蔗糖水解雙還原糖產生，蔗糖水解是右旋糖酐的8倍，說明同一鹽酸水解條件下，蔗糖水解具有極強的競爭性，蔗糖殘存較多的粗酐鹽酸水解時會受到一定的影響。表2是在右旋糖酐40制備工藝改進研究中的現象，右旋糖酐發酵維持在一定水平時，發酵液經過板框過濾、陶瓷膜微濾及超濾等發酵液后處理為粗酐液，粗酐液鹽酸水解后，水解液的還原糖含量與右旋糖酐的重均分子量呈現反向關系，還原糖越高，重均分子量越底。當發酵異常，發酵水平過低時，發酵液的后處理工藝條件不變的前提下，水解液還原糖含量出現較大的增加，但右旋糖酐的重均分子量沒有下降而是升高。原因在于，發酵水平下降，發酵液蔗糖殘存增大，后處理后的粗酐溶液中蔗糖殘存同樣增大，粗酐鹽酸水解時就會發生蔗糖的競爭水解，還原糖增加較多，但右旋糖酐的水解大大折扣，重均分子增高。這就是長期以來困擾右旋糖酐原料藥生產中分子量分布難以控制的原因，要想改變這一狀況，需要在水解工藝上尋找新的出路。

圖1 蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性

表2 右旋糖酐的鹽酸水解

2.2 右旋糖酐酶的專一性

右旋糖酐和蔗糖在0.5%的底物濃度，pH5.0，0.16 IU·mL-1酶濃度，時間10 min，溫度50℃的條件下酶解反應，進行還原糖測定(見圖2)。結果表明右旋糖酐被右旋糖酐酶酶解，而蔗糖沒有發生反應，與2.1中的鹽酸水解完全不同，說明右旋糖酐酶具有高度的專一性，其可以選擇性地降解右旋糖酐中的α-1,6葡萄糖苷鍵，對蔗糖中的糖苷鍵沒有作用。右旋糖酐酶用于右旋糖酐的降解可以克服鹽酸水解出現的非專一性降解，避免了粗酐中的蔗糖殘留競爭水解，有利于右旋糖酐的水解條件的控制，保證了水解液分子量分布的穩定性，有利于后處理及不同分子量右旋糖酐的分離純化。右旋糖酐的酶解結果也進一步予以說明(見表2)。雖然右旋糖酐發酵水平有所不同，但發酵液經過相同后處理用于右旋糖酐酶解，酶解液中還原糖的變化和重均分子量的大小的關系沒有因發酵水平不同而異常，基本呈現相同的變化趨勢：還原糖變化大，重均分子量則低。

2.3 不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性

在相同條件下對重均分子量不同的T-5，T-10，T-40，T-500，T-1000，T-2000和T-10000以上的右旋糖酐進行鹽酸水解，測定其還原糖的變化(圖3)。從T-5到T-2000還原糖無明顯變化，基本保持在同一水平，T-10000遠遠高于其他。在同一鹽酸水解環境中，T-10000的水解性強于其他，易于被水解；而T-5到T-2000水解性相當，被同步水解，大分子降解為小分子，小分子降解成更小分子，使得右旋糖酐水解液中的分子量分布過于分散而不均，不利于目標分子量右旋糖酐的分離純化。而右旋糖酐酶的底物特異性表明，隨著右旋糖酐分子量的增大，酶的親和力增強，高分子量的易于降解，可以改善右旋糖酐酶解液分子量分布，易于低分子量右旋糖酐的制備[6]。

圖2 右旋糖酐酶的專一性

表3 右旋糖酐的酶解

圖3 不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性

表4 右旋糖酐鹽酸水解與右旋糖酐酶酶解比較

從右旋糖酐鹽酸水解液和右旋糖酐酶解液分子量分布(表4)可以看出，在重均分子量40 000～70 000之間，重均分子量相當時，酸解10%大分子的分子量比酶解10%大分子的分子量高出100 000，10%小分子前者低于后者1 000，酶解分子量分布比酸解分子量分布相對集中，酶解可以改善分子量的分布；在在重均分子量20 000～40 000之間，重均分子量相當時，酸解和酶解10%大分子的分子量基本無差別，但酸解10%小分子的分子量比酶解10%小分子的分子量低2 000多，酶解分子量分布優于酸解分子量分布，酶解也改善了分子量的分布。總之，右旋糖酐酶酶解右旋糖酐可以改善分子量的分布，從而有益于通過降解高分子右旋糖酐制備低分子量右旋糖酐。

2.4 不同水解方法制右旋糖酐40

右旋糖酐分別用鹽酸和右旋糖酐酶降解制備右旋糖酐40，結果見表5、表6。鹽酸水解制備的右40分子量分布為，重均分子量33 000～36 000，10%大分子<120 000，10%小分子>5 000；右旋糖酐酶酶解制備的右旋糖酐分子量分布為，重均分子量38 000～42 000，10%大分子<110 000，10%小分子>7 000。前者達中國標準，后者改善了分子量分布，達到歐洲標準。但是鹽酸水解右旋糖酐40的產率高于右旋糖酐酶解右旋糖酐40產率，最高差達7%，這就需要進一步優化右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40等低分子右旋糖酐產品工藝條件，在提高產品質量的同時提高產率，使得酶解工藝能夠替代酸解工藝用于右旋糖酐40等低分子右旋糖酐產品的生產。

表6 右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40

3 結論

在右旋糖酐40等原料藥工藝改進研究中遇到右旋糖酐發酵水平有明顯降低時，粗酐鹽酸水解時的還原糖變化和右旋糖酐分子量分布關系異常，即還原糖變化超出正常數倍，而分子量沒有降低，反而高于正常。分析原因可能是粗酐中的殘留蔗糖也發生酸解，且蔗糖酸解競爭性強于右旋糖酐。蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性試驗表明，同一鹽酸水解條件下，蔗糖水解具有極強的競爭性，發酵水平下降，發酵液蔗糖殘存增大，后處理后的粗酐溶液中蔗糖殘存同樣增大，粗酐鹽酸水解時就會發生蔗糖的競爭水解，還原糖增加較多，但右旋糖酐的水解大大折扣，重均分子增高。這就是長期以來困擾右旋糖酐原料藥生產中分子量分布難以控制的原因。用蔗糖和右旋糖酐進行了右旋糖酐酶專一性研究，結果表明右旋糖酐酶不降解蔗糖，可以專一性的降解右旋糖酐，右旋糖酐酶解結果表明，右旋糖酐發酵水平的變化對右旋糖酐酶酶解沒有影響。不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性試驗表明，在同一鹽酸水解環境中，T-10000的水解性強于其他，易于被水解；而T-5到T-2000水解性相當，被同步水解，大分子降解為小分子，小分子降解成更小分子，使得右旋糖酐水解液中的分子量分布過于分散而不均，不利于目標分子量右旋糖酐的分離純化。而右旋糖酐酶的底物特異性表明，隨著右旋糖酐分子量的增大，酶的親和力增強，高分子量的易于降解，可以改善右旋糖酐酶解液分子量分布，易于低分子量右旋糖酐的制備。分別采用鹽酸水解和右旋糖酐酶酶解兩種水解方法制備右旋糖酐40，結果表明，前者重均分子量低于后者，10%大分子大于后者，10%小分子小于后者，前者達到中國標準，后者達到歐洲標準。右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40等原料藥可以改善分子量分布。但是酶解制備右旋糖酐40的收率低于酸解，這就需要進一步研究酶解工藝條件，在提高產品質量的同時提高產率。再就是酶解引入酶蛋白，對于水解液后處理及產品的分離純化提出新的要求，需要對工藝條件進一步研究。