番茄內生枝孢霉Wx103對根結線蟲毒性的研究

姚玉榮 霍建飛 郝永娟 劉春艷 王萬立

摘要：本研究從番茄根結中分離得到一株根結線蟲的內生生防真菌Wx103，經鑒定為Acremonium sclerotigenum。該菌株發酵液對南方根結線蟲2齡幼蟲具有較強的毒殺活性，發酵液處理24 h后的校正死亡率為90.25%，處理7 d對卵孵化抑制率為41.04%;盆栽試驗中孢子液處理線蟲防效為68.72%，與3%阿維菌素微囊懸浮劑處理無顯著差異。本研究豐富了根結線蟲生物防治的微生物資源，可為該菌株的開發利用提供一定的理論基礎。

關鍵詞：內生真菌;根結線蟲;Wx103;防效

中圖分類號：S476.1 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0101-05

Abstract A strain of endophytic fungus Wx103 was screened from tomato with high efficacy against root knot nematode and was identified as Acremonium sclerotigenum. Its fermentation solution had stronger lethal activity against the two-instar larva， and the corrected mortality was 90.25% after treated for 24 hours. Furthermore， the Wx103 strain exhibited higher ovicidal efficacy of 41.04% after treated for 7 days. In the pot experiment， the root galls caused by Meloidogyne incognita decreased by 68.72%， which was not significantly different from 3% abamection micro-capsule SC. The finding of the study enriched the microbial resources against root-knot nematode， and provided references for development and utilization of this strain.

Keywords Endophytic fungus; Root-knot nematode; Wx103; Control effect

根結線蟲（Meloidogyne spp.）是一類主要侵染植物的病原微生物，也是世界各國對外檢疫的重要對象，它給全球農業生產帶來了極大危害[1]。自1932年首次報道番茄根結線蟲病害發生以來，我國發生省區已超過十個。近年來保護地蔬菜的迅猛發展加速了該病害的發生，致使該病害成為限制保護地蔬菜發展的主要因素，防控形勢相當嚴峻[2]。

植物內生真菌是指生活史的某一階段或者全部階段生活在健康植物組織內部，但并不引起宿主植物病害癥狀的一類真菌[3]。內生真菌能夠通過提高寄主植物抗性、改變寄主植物對病蟲害的應答反應來提高寄主植物對逆境及病蟲害的抵抗。內生真菌防治植物寄生線蟲具有明顯優勢，其存活于植物體內，可避免與土壤微生物競爭，并與寄生線蟲處于相似的生態位，能夠更充分地發揮作用，從而提高生物防治微生物的靶向性和高效性。 West等[4]研究表明，內生尖孢鐮刀菌Fosurium oxysporum能夠顯著降低南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）對番茄的侵染率，與對照相比線蟲數量減少36.0%～55.9%。根部內生真菌印度梨形孢（Piriformospora indica）不僅能夠顯著降低大豆胞囊線蟲的種群密度，還能提高寄主植物生物和非生物抗性[5]。目前已經報道的防治線蟲的內生真菌主要從屬于枝孢霉屬（Acremonium）[4，6]、毛殼菌屬（Chaetomium）[7]、鐮刀菌屬（Fusarium）[8-10]、黑盤孢屬（Melanconium）[11]、青霉菌屬（Penicillium）[12]、擬莖點霉屬（Phomopsis）[11]等。生產中根結線蟲的防治通常采用化學農藥防治、生物防治及抗病品種利用等，化學農藥主要包括阿維菌素、噻唑膦等。

本研究擬從番茄根結中分離根結線蟲生防菌，繼而對篩選得到的生防菌株進行形態學和分子生物學鑒定，再分別利用菌株發酵液浸泡和盆栽試驗測定其對根結線蟲的防治效果，以期為根結線蟲病的防治提供新的生防資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

番茄根結樣品采集地點為天津市武清區下伍旗溫室大棚。該棚種植番茄多年，根結線蟲病發病嚴重。

1.2 真菌菌株Wx103的分離鑒定

采用常規組織分離法。將新鮮的番茄根結清洗干凈，用無菌刀片削除根結表皮，0.5%次氯酸鈉浸泡30 s，無菌水清洗3次，滅菌紙吸干水分后切成小塊，再置于含有0.1 g/L氨芐青霉素的PDA培養基上。之后于培養箱中培養3～4 d，待長出菌絲后進行單孢純化，并將分離得到的菌株保存備用。其中，一株真菌命名為Wx103。

依據形態學和分子生物學方法分別對菌株 Wx103進行鑒定。參考《中國真菌志》進行形態學鑒定，分子生物學鑒定則采用ITS序列分析。將分離得到的菌株接種到PDA培養基上，置于25℃培養，收集菌絲，后用CTAB法提取總DNA。利用真菌ITS序列通用引物ITS1（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[13]進行PCR擴增。擴增體系：2×EsTaq Master Mix（Dye）25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。擴增程序：94℃ 4 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，共35個循環;72℃ 10 min。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天津金唯智生物科技有限公司測序。測序結果用BLAST進行同源性分析，并通過MEGA 5.0軟件用鄰接法構建系統發育樹，在分子水平上鑒定菌株種類。

1.3 Wx103發酵液的制備

挑選PDA平板上生長良好的菌落，取直徑0.5 cm的菌餅接種于含PDB的三角瓶中，28℃、120 r/min培養5 d得到真菌發酵液，再經5 000 r/min離心15 min，得發酵上清液（以下稱發酵原液）。

1.4 南方根結線蟲卵及其二齡幼蟲J2的制備

南方根結線蟲來源于天津市植物保護研究所蔬菜病害室。將感染南方根結線蟲的辣椒苗病根洗凈，解剖鏡下挑取新鮮卵塊，用0.5% NaClO表面消毒，清水洗凈。一部分卵塊經0.5% NaClO振蕩解離后，收集游離卵制備卵懸浮液（每毫升卵量約1 000個），另一部分卵在28℃孵化出南方根結線蟲二齡幼蟲J2。

1.5 Wx103發酵液對根結線蟲毒力測定

1.5.1 對根結線蟲卵的生物活性 試驗設置3個處理，分別為：Wx103發酵原液、陽性對照（3%阿維菌素微囊懸浮液稀釋2 000倍）、對照（無菌水）。取100 μL濾液于96孔板的小孔中，每處理加入約100個南方根結線蟲卵，重復3次。置25℃孵化，于3、5、7 d統計根結線蟲孵化量，計算卵孵化抑制率：

抑制率（%）=（對照線蟲孵化量-處理線蟲孵化量）/對照線蟲孵化量×100 。

1.5.2 對根結線蟲二齡幼蟲的生物活性 處理設置同1.5.1，采用觸殺法進行殺線蟲活性測定。取100 μL濾液于96孔板的小孔中，每處理加入約100條南方根結線蟲，重復5次，置25℃培養，分別于24、48 h后統計死亡線蟲數量（將線蟲在清水中恢復2 h，線蟲僵直，針刺不動視為死亡），計算校正死亡率：

校正死亡率（%）=（處理死亡率-對照死亡率） /（1-對照死亡率） ×100 。

1.6 Wx103孢子液對根結線蟲防效的盆栽鑒定

將菌株Wx103接種于200 mL PDB溶液（含有100 mg/mL氨芐青霉素鈉）中，28℃、150 r/min恒溫培養3 d后，過濾菌絲，收集孢子，統計孢子濃度并將其調至107 cfu/mL。每千克土加入100 mL菌液，混勻。待番茄幼苗兩片真葉完全展開后移栽到拌好孢子液的土壤中，14 d后每株接線蟲1 000條，每處理15株，重復3次。接種線蟲45 d后清洗番茄根部，根據蔬菜根結線蟲分級標準統計根結情況，計算菌株對根結線蟲的防效[14]：

防效=（空白對照根結數-處理根結數）/空白對照根結數×100% 。

1.7 數據分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進行數據統計， SAS 9.1軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

試驗用菌株Wx103在PDA培養基上培養5 d后，菌落呈現白色（圖1）。

通過對測序結果進行BLAST序列比對發現，分離菌株在進化樹上與枝孢霉Acremonium sclerotigenum isolate HB2同源性達到99.8%（圖2），結合菌株形態特征，將菌株鑒定為Acremonium sclerotigenum strain Wx103。

2.2 Wx103發酵原液對南方根結線蟲卵的生物活性

由圖3可以看出，與對照（抑制率為零）相比，發酵原液對南方根結線蟲卵囊孵化具有抑制作用。發酵原液處理3 d對南方根結線蟲卵囊孵化的抑制率達到70.06%，但顯著低于3%阿維菌素微囊懸浮劑處理的抑制率92.09%;處理5、7 d時，發酵液對卵孵化的抑制率分別為57.02%和41.04%，均顯著低于同期的3%阿維菌素微囊懸浮劑處理。

2.3 Wx103發酵原液對南方根結線蟲二齡幼蟲J2的生物活性

由圖4可以看出，菌株Wx103發酵原液處理根結線蟲J2，其24 h的校正死亡率達到90%以上，與3%阿維菌素微囊懸浮劑處理的致死活性相當。發酵原液稀釋2、4、10倍后，殺線蟲活性并未顯著降低，表明真菌Wx103發酵原液中含有高效殺線蟲活性物質。

2.4 Wx103孢子液對根結線蟲防效的盆栽試驗

由圖5可以看出，Wx103孢子液處理的番茄根結平均數量為28.55個，3%阿維菌素微囊懸浮劑處理的為23.71個，對照則高達91.29個。孢子液和3%阿維菌素微囊懸浮劑處理對根結線蟲的防效分別為68.72%和74.09%，兩者并無顯著差異（圖6）。觀察發現，孢子液處理的番茄根結數量少、根系發達、植株健壯，而對照根結較多、須根少，這表明菌株Wx103不僅能夠降低根結線蟲的侵染，同時能夠促進番茄生長。

3 討論與結論

大多數內生真菌對根結線蟲的影響是通過產生次級代謝產物作用于線蟲體內的酶系或代謝反應抑制或者殺死線蟲[15]。內生尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum FO162發酵液處理線蟲60 min后，90%的線蟲喪失活力，處理24 h后的線蟲死亡率高達100%[8]。Schwarz等[11]報道了內生真菌代謝產生的3-Hydroxypropionic acid物質對南方根結線蟲的毒殺活性。Tian等[16]利用從番茄根結上分離的內生真菌交枝頂孢Acremonium implicatum處理南方根結線蟲48 h后，線蟲死亡率可達96%以上，盆栽試驗中該菌株對根結線蟲的防效達到66.7%。Kpcke等[17]證實內生子囊菌代謝產生的次級代謝物內酯類化合物對南方根結線蟲具有良好的致死活性。

本研究從番茄根結中分離得到一株內生真菌，經鑒定為Acremonium sclerotigenum，其發酵液對南方根結線蟲J2具有較強毒性，能夠抑制根結線蟲卵囊孵化。盆栽試驗結果顯示該菌株孢子液顯著降低了根結數量，對南方根結線蟲的防治效果與3%阿維菌素微囊懸浮劑相當。可以推測在菌株孢子液中存在對南方根結線蟲具有較強毒性的代謝產物，這種物質多為次級代謝產物。因此，番茄內生真菌Acremonium sclerotigenum strain Wx103對根結線蟲具有生防作用，在后續的研究中應深入挖掘發酵液中活性的物質成分，為該菌株生防菌劑的開發提供理論依據。

參 考 文 獻：

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