基于mtCOI基因對入侵山東各地草地貪夜蛾的分子鑒定

王鵬 賀培從 朱軍生 國棟 褚棟

摘要：草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是新傳入我國的重要害蟲。本研究利用mtCOI基因作為分子標記，對傳入山東省9個地市17個縣（市、區）的49個草地貪夜蛾樣本進行分子鑒定。結果表明，山東地區共發現兩個mtCOI單倍型，系統發育分析表明分別隸屬于玉米型與水稻型，其中傳入濟寧梁山的為玉米型（占6.1%），其余地區均為水稻型（93.9%）。本研究明確了傳入山東省的草地貪夜蛾單倍型及其分布，對該蟲的預警與防控具有參考價值。

關鍵詞：草地貪夜蛾;mtCOI;水稻型;玉米型;山東省

中圖分類號：S433.4 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0097-04

Abstract As an important pest introduced into China this year， Spodoptera frugiperda has been discovered in Shandong Province leading to a serious threat to the food security. In this study， the mitochondrial COI gene was used as a molecular marker to identify 49 S. frugiperda samples from 17 districts of 9 cities in Shandong Province. The results showed that two mtCOI haplotypes were identified， and the individuals from Liangshan of Jining City belonged to corn strain （6.1%） while the rest belonged to rice strain （93.9%）. In this study， the haplotypes of S. frugiperda and their distribution in Shandong Province were clarified， which had important guiding significance for the future risk assessment and management of this pest.

Keywords Spodoptera frugiperda; mtCOI; Corn strain; Rice strain; Shandong Province

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（Smith），又稱秋粘蟲，屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）。該蟲原產于美洲熱帶和亞熱帶地區，具有雜食性、遷飛性、暴發性以及繁殖力強等特點，近年來逐漸成為一種世界范圍的重大入侵農業害蟲[1]。該蟲自今年傳入我國以來，已在至少22省1 280個縣（市、區）為害，發生面積超過80萬公頃[2]。山東省于2019年6月20日在臨沂市郯城首次通過誘捕器發現一只雄蟲，7月16日在滕州市首先發現幼蟲為害。目前，山東半島、魯南和魯西南地區均發現該蟲為害。

草地貪夜蛾具有極廣的食物譜，能危害80多種作物，特別是能導致玉米、水稻、高粱、牧草等禾本科作物嚴重減產[3]。該蟲分為水稻型（rice strain）和玉米型（corn strain），兩者在表型上幾乎無法區分，性信息素組分也相同，甚至可以雜交產生可育后代[4]。但在寄主植物種類的偏好性、交配行為以及性信息素組分的比例等方面存在一定差異[5-7]。對草地貪夜蛾進行分子鑒定、明確傳入山東的草地貪夜蛾亞型，有助于了解該害蟲傳入途徑，可為其生物學特性研究奠定基礎，對該害蟲的防控具有重要意義。

目前，線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（mtCOI）[8-10]以及位于核基因組Z染色體上的磷酸甘油醛異構酶基因（Tpi）[11，12]被作為草地貪夜蛾鑒定以及區分不同亞型的主要分子標記。通過兩種標記基因的鑒定，發現入侵我國的草地貪夜蛾種群線粒體基因組絕大多數為水稻型，而基于核基因組Tpi基因分析則全部為玉米型[13，14]。目前，入侵山東地區草地貪夜蛾的亞型和種群遺傳特征尚不明確。

本研究利用mtCOI基因，對采集自山東境內49個草地貪夜蛾樣品進行分子鑒定，以期進一步明確蟲源信息及其發生特征和暴發規律，并為指導山東草地貪夜蛾的監測預警和早期控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為山東省各地初期發現的草地貪夜蛾疑似樣本，共49個個體，均為4～6齡期幼蟲。采集地點包括青島、煙臺、威海、日照、臨沂、濟寧、菏澤、聊城、棗莊等地市下屬的17個縣（市、區）。寄主均為苗期至抽雄初期的玉米，每地點樣品數1～6個。樣品采集后，活體常溫運送至實驗室進行下一步的鑒定和檢測工作。

1.2 DNA提取及PCR擴增

樣品DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒。單頭蟲體用液氮研磨后，按照說明書進行提取，后利用純化的DNA作為模板，對mtCOI基因片段進行PCR擴增。引物序列參照Nagoshi等[11]的設計，上游引物：5′-TTCGAGCTGAATTAGGGACT-3′，下游引物：5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′。PCR反應體系（13 μL）：DNA 模板1.5 μL，buffer 1.3 μL，上下游引物各0.26 μL，dNTP 0.26 μL，Taq酶0.13 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環;72℃延伸10 min。PCR擴增結束后，使用1%瓊脂糖電泳檢測擴增結果，選取與目標片段長度一致的單一片段PCR產物切膠、回收并送擎科生物股份有限公司測序。

1.3 數據分析

從GenBank數據庫中下載部分已發布的草地貪夜蛾（已確認的玉米型和水稻型）對應基因序列，以棉鈴蟲mtCOI序列作為外群構建系統進化樹。選取Kimura-2參數模型，依據鄰接法（NJ）構建系統進化樹，系統樹各分支的自舉檢驗值（bootstrap）1 000次重復檢驗。

2 結果與分析

2.1 草地貪夜蛾mtCOI單倍型判斷與系統發育分析

將山東各地區樣本的mtCOI基因序列進行比對分析，發現山東省的mtCOI基因僅有兩個單倍型，分別命名為山東單倍型1和山東單倍型2。系統發育分析（圖1）發現，山東單倍型1的mtCOI序列與來自中國廣東、印度、巴西、南非、美國的水稻型序列聚在一起，應屬于水稻型;山東單倍型2的序列與美國、中國廣東、墨西哥玉米型序列聚在一起，應屬于玉米型。

2.2 草地貪夜蛾mtCOI單倍型的分布

山東地區采集的49個個體中，山東單倍型1共46個，占93.9%，分布于青島市城陽、即墨、膠州、平度和棗莊市滕州、日照市嵐山、日照市五蓮、臨沂市臨沭、臨沂市郯城、煙臺市海陽、威海市乳山、威海市榮成、煙臺市牟平、聊城市東昌府、菏澤市東明和菏澤市鄄城共16個縣（市、區）;山東單倍型2共3個個體，占6.1%，均出自濟寧市梁山（表1，圖2）。

3 討論與結論

本研究以mtCOI作為分子標記，對首次入侵山東各地的草地貪夜蛾樣本進行了分子鑒定，結果發現兩個mtCOI單倍型，分別屬于玉米型和水稻型，其中屬于水稻型的單倍型樣本占絕大多數，因此，入侵山東省的草地貪夜蛾并非單一來源。張磊等[14]研究發現，侵入中國地區的草地貪夜蛾的線粒體基因組以水稻型為主，玉米型僅占極少數。本試驗結果與其基本一致。

草地貪夜蛾的不同亞型直接決定對寄主植物的取食偏好性。目前入侵的草地貪夜蛾以為害玉米為主，但也陸續發現其在小麥、花生、水稻和大豆等作物上的為害證據[15-17]。本研究通過分子鑒定，明確入侵山東草地貪夜蛾的線粒體單倍型構成，為進一步探究草地貪夜蛾寄主選擇和種群遺傳學信息的關系奠定了基礎，對今后草地貪夜蛾的風險評估、精準監測預警和綠色防控具有重要指導意義。

參 考 文 獻：

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