接種比對葉菜類尾菜厭氧發酵產沼氣性能影響的研究

付龍云 李彥 趙自超 張柏松 袁長波 井永蘋 曲召令 王艷芹

摘要：以葉菜類尾菜為主要原料進行厭氧發酵，常因“過酸化”導致產氣失敗，為提高其能源化利用效率，本研究系統比較了10% 、20% 、30%和40%接種比對產沼氣性能的影響。結果表明：接種比為10%和20%時，丙酸、乙酸和氨氮濃度失衡，pH值最低可至4.82和5.50，系統出現不同程度的“過酸化”現象，產氣停滯或大大減少，甲烷含量低;而接種比為30%和40%時，丙酸、乙酸和氨氮濃度維持良好平衡，pH值基本維持中性，產氣正常。采用較高的接種比對于葉菜類尾菜厭氧發酵正常產氣至關重要，同時鑒于30%和40%接種比產氣效果差別不大，從經濟性角度考慮，確定30%為最佳接種比。

關鍵詞：接種比;葉菜類尾菜;厭氧發酵;沼氣;過酸化

中圖分類號：S216.4 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0075-08

Abstract Anaerobic fermentation with leafy vegetable residues as main material to produce biogas might be failed due to the superacidulation. Aimed to promote the energy utilization of leafy vegetable residues， we compared the effects of different inoculation concentrations （10%， 20%， 30% and 40%） on the biogas production performance. The results indicated that with the inoculation concentrations of 10% and 20%， the balance of propionate， acetate and ammonia nitrogen was lost， and the minimum pH value was only 4.82 and 5.50 with superacidulation， so the biogas production was poor and the methane yield was low. But with the inoculation concentrations of 30% and 40%， the balance of propionate， acetate and ammonia nitrogen was well， and the system pH was nearly neutral， so the biogas production performance was well. Therefore， higher inoculation concentration was crucial for better production performance of biogas by anaerobic fermentation with leafy vegetable residues. Considering economical efficiency， the inoculation concentration of 30% was recommended due to the similar biogas production performance between 30% and 40% of inoculation concentration.

Keywords Inoculation concentration; Leafy vegetable residues; Anaerobic fermentation; Biogas; Superacidulation

隨著市場需求的不斷擴大和農業生產技術的飛速發展，近年來，我國蔬菜產業取得了長足進步，蔬菜已成為僅次于糧食的第二大類農作物。據國家統計局統計年鑒，2018年我國各類蔬菜種植面積逾2 000萬公頃，年產量超7億噸，均居于世界首位。山東、遼寧等蔬菜產業大省已形成集育種、栽培、采收、加工、運輸等不同環節于一體的完整產業鏈，不但可供應區域內市場，而且可滿足全國及國外消費者的不同需求。然而，蔬菜產業鏈的各環節中大量尾菜的產生難以避免，已成為影響城鄉生態環保和人居環境的重要因素[1]。尾菜是指蔬菜產業各環節中產生的無商品價值的殘葉、爛果、枯枝、藤蔓等農業廢棄物，其總量甚至可達蔬菜產量的30%以上[2]。大量尾菜堆積在田間地頭、加工廠和菜市場等場所，如果任其腐敗變質、孳生蚊蠅，不但嚴重影響環境衛生，而且造成資源的巨大浪費。其中，白菜、萵苣、芹菜等葉菜類產生的尾菜含水量高，糖類、蛋白質等組分豐富，更難以長期儲存和運輸，極易腐敗變質而引發固廢、污水、惡臭等各種環境問題，亟需進行合理的無害化和資源化處理。目前常用的處理途徑主要有飼料化、能源化、肥料化、基質化和材料化等方式[3]，其中，以厭氧沼氣發酵為代表的能源化利用方式對尾菜品質要求不高，可實現對蟲卵、植物病菌的高效滅殺，沼渣沼液可作為優質肥料，尤其適合在露地蔬菜、設施蔬菜等不同類型蔬菜種植密集區推廣[4]。

然而，由于葉菜類尾菜自身極易被微生物分解、利用的顯著特點，使得厭氧沼氣發酵中易出現消化速度過快、大分子有機物迅速轉化為丙酸、乙酸等揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），超出了乙酸營養型產甲烷菌為主的沼氣微生物菌群的利用能力，而在短時間內導致VFAs的超量累積，環境pH值迅速下降至沼氣微生物菌群忍受閾值以下，導致產氣停止，出現所謂“過酸化”現象[5，6]。該現象在以蔬菜廢棄物為原料的沼氣發酵工程中時有出現，常表現為有機負荷陡升引起發酵失敗，其正常發酵的保持和恢復需要耗費大量的人力物力，往往需要發酵過程中投加堿性物質、更換發酵菌群等，手段繁復而效果不穩定[7]。如果在發酵初始階段即對“過酸化”現象進行預防，穩定厭氧發酵進程，可減少中間人工干預環節，從根本上保證發酵產氣的正常進行。目前常見的預防“過酸化”措施主要從底物構成、發酵工藝和接種物等角度著手，分為：使用不同物料混合發酵、新型厭氧發酵工藝和使用富含氫營養型產甲烷菌的接種物等不同方式[8-10]。但是，這些方式往往會受到原料來源、技術設備、接種物獲取等方方面面的限制。而有研究發現，在厭氧發酵中采用適當的接種比亦可以有效避免“過酸化”等不良現象，取得不錯的產氣效果，如：陳智遠等[11]研究玉米秸稈厭氧發酵時發現，提高接種量可以有效防止發酵前期偏酸，并縮短發酵啟動時間;任海偉等[12]在研究不同接種量對青貯玉米秸稈與牛糞混合消化產沼氣性能的影響時發現，30%的接種量相對于20%和25%的接種量，發酵時秸稈木質纖維結構破壞最嚴重，產氣效果最好。

為促進農業廢棄物沼氣化合理利用，結合山東省蔬菜種植區葉菜類尾菜資源豐富的特點，本試驗以收獲后丟棄的白菜、芹菜和萵苣混合尾菜為原料，以豬糞厭氧發酵后的沼渣沼液為接種物，研究不同接種比對厭氧發酵產沼氣性能的影響及發酵過程中丙酸、乙酸、氨氮（NH4+-N）、pH值等重要參數的變化，以避免“過酸化”不利影響和提高產沼氣效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵原料為收獲后丟棄的白菜、芹菜和萵苣混合尾菜，取自山東省某設施菜田，粉碎至1～2 cm顆粒。接種物為豬糞厭氧發酵后的沼渣沼液混合物。發酵物料及接種物的總固體（total solid，TS）、揮發性固體（volatile solid，VS）、總碳（total carbon，TC）、全氮（total nitrogen，TN）、碳氮比（C/N）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、粗纖維（crude fiber，CF）等理化性質見表1。

1.2 發酵裝置

試驗裝置主要由發酵瓶、集氣袋和培養箱組成。發酵瓶為2.5 L具橡膠塞玻璃瓶，橡膠塞上打雙孔，分別用于發酵液采樣和連接集氣袋;集氣袋為5 L鋁箔氣體采樣袋（普萊特，大連）。發酵瓶、集氣袋之間以玻璃彎管、橡膠管連接。發酵物料裝載并混勻后，將發酵瓶和集氣袋整體移入培養箱，設置溫度為35℃。試驗期間每天手動搖動發酵瓶兩次，確保發酵物料混合均勻，并防止發酵液分層、結殼。

1.3 試驗設計

試驗采用中溫厭氧發酵，溫度35℃，運行周期30天。根據接種比（接種物與所有發酵物料的質量百分比）的不同設4個處理，即：10%、20%、30%、40%，同時設置1個只含接種物的對照，分別記為T1、T2、T3、T4和T0。每處理均設3個重復。試驗各發酵瓶總裝樣量均為2 000 g，葉菜類尾菜統一為500 g，尾菜和接種物裝入后，均以無菌水補足至2 000 g，上部留出空間為產氣室。所有物料一次性裝入后，充分混勻，用N2向發酵瓶內上部空間連續吹入2 min以排出空氣。試驗周期內每天采集氣體測定產沼氣量和甲烷濃度，每3天抽取發酵液測定pH值、乙酸、丙酸等化學指標。具體發酵物料組成詳見表2。

1.4 指標測定

沼氣產量采用濕式氣體流量計（TG1，Ritter，德國）測定;甲烷含量采用氣相色譜儀（GC1100，普析，北京）測定，色譜方法設置為：使用填充色譜柱（TDX-01，島津，日本），以高純H2為載氣，用熱導檢測器（TCD 檢測器），分別設置儀器進樣口、檢測器溫度為110、150℃，柱箱初始溫度設為40℃，保持2 min后以10℃/min升溫至80℃并保持1 min;丙酸、乙酸濃度采用氣相色譜儀（GC2014，島津，日本）測定，色譜條件：使用毛細管柱（DB-WAX，安捷倫，美國），以高純N2為載氣，用氫離子火焰檢測器（FID檢測器），分別設置儀器進樣口、檢測器溫度為250、300℃，柱箱程序升溫，初始溫度設置為110℃，保持1 min后以10℃/min升溫至250℃并保持5 min;WSC采用硫酸-蒽酮比色法測定[13];氨氮、CP采用凱氏定氮儀（Kjel master K-375，BUCHI，瑞士）測定;EE按照乙醚索氏抽提法測定[14];CF采用全自動纖維分析儀（Fibertec 2010，FOSS，瑞典）測定;TC、TN采用總有機碳/有機氮分析儀（vario TOC，Elementar，德國）測定;TS、VS和pH值均按照文獻[15]所述方法進行測定。

1.5 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2013和Origin 2018軟件進行統計和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理沼氣日產量變化與累積產氣量比較

不同接種物濃度條件下，各處理組沼氣日產量情況如圖1所示。30 d的試驗周期，各處理組沼氣日產量均呈先升高后再降低的總趨勢，且均在試驗開始的第一天出現一個“產氣高峰”，但結合甲烷濃度分析（圖3），此“產氣高峰”甲烷含量很低，結合文獻報道可知，此時產生的大量氣體主要由尾菜細胞自身呼吸代謝、微生物分解作用等途徑產生，并非進入產甲烷階段[16，17]。發酵第2 d各組產氣驟降，此后各處理組產氣逐步升高，逐漸啟動產甲烷發酵，進入主產氣階段：當接種比為10%時，第5 d達到產氣高峰，為1.43 L/d，此后迅速降低至基本不產氣;當接種比為20%時，第6 d達到產氣高峰，為2.05 L/d，此后逐漸降低并在第22 d出現一個明顯的次產氣高峰;而接種比為30%和40%時，沼氣日產量變化曲線比較接近，均在第6 d到達產氣高峰，分別為2.95 L/d和3.17 L/d，此后也逐步降低，并又分別出現多個次產氣高峰。多個產氣高峰的出現與物料中WSC、CP、EE和CF等不同成分降解難易程度和發酵菌群適應性等因素有關[18，19]。接種比為30%和40%時產氣高峰出現較多，也一定程度上說明此接種比條件下物料各成分能夠得到較好利用。

由圖2看出，接種比分別為10%、20%、30%和40%時，扣除完全為接種物的空白對照組T0產氣量后，T1、T2、T3、T4各處理累積產氣量分別為5.84、22.00、42.91、43.22 L。T1累積產氣量顯著較低，T2累積產氣量高于T1 2.77倍，而T3和T4處理累積產氣量相近且較高，分別高于T1 6.35倍和6.40倍。說明本試驗條件下，接種比對產氣量影響較大，采用較高的接種比能夠獲得更優的產氣效果，但是超過一定限度則提升不大。此結果與任海偉[12]、劉榮厚[20]等的研究結論一致。

2.2 不同處理甲烷（CH4）濃度變化

試驗周期內，各處理組甲烷濃度變化如圖3所示。T1、T2處理組甲烷濃度變化呈現顯著的先升高后降低趨勢，甲烷濃度均在發酵第6 d達到最高值，分別為25.08%和37.80%，隨后迅速下降。T1組在產氣迅速停止的同時，甲烷濃度也逐步趨近于0;而T2組甲烷濃度則在降至約15%后，降速逐步放緩，至試驗結束時為8.35%。結合文獻報道和生產實踐來看，低甲烷濃度的沼氣缺乏利用價值，不但占用儲氣空間，經濟性差，而且給發電、燃用、提純等后續利用環節造成較大難度[21]。相對而言，T3和T4處理組甲烷濃度峰值較高，分別為67.21%和67.33%，分別高于T1最高值1.68倍和1.69倍，而且甲烷濃度升高后，均能夠在試驗周期內保持基本穩定，至試驗結束時仍分別高達62.67%和63.76%，具有良好的利用價值。可見，不同接種比對葉菜類尾菜厭氧發酵所產沼氣濃度影響顯著，采用較高接種比時，接種物能夠給發酵體系迅速帶來足夠的產甲烷菌群，確保甲烷的順利產生;而采用較低的接種比則嚴重影響產甲烷菌群優勢的建立，并將直接導致高質量沼氣無法順利獲得。

2.3 不同處理pH值與丙酸、乙酸濃度變化

作為一個復雜微生物過程，厭氧沼氣發酵一般分為有機串聯的“大分子分解”、“脂肪酸產生”和“甲烷產生”三個重要步驟，由包含梭菌、產甲烷菌等多種功能微生物的沼氣微生物菌群共同完成。其體系pH值保持一定范圍的相對穩定對于維持菌群活性十分重要。有研究表明，當環境pH值低于5.0時，產甲烷菌的活性即受到完全抑制[22]。由于葉菜類尾菜可生化性好、極易被微生物分解，揮發性脂肪酸累積速度快，很容易超過產甲烷菌耐受范圍而出現“過酸化”現象，因而此類原料發酵過程中pH值和揮發性脂肪酸的變化情況需要重點監控。如圖4所示，接種比為10%時，發酵液pH值在發酵開始后逐步降低，至第6 d低至4.82，此后一直在5.0以下未能恢復;接種比為20%時，發酵液pH值第6 d低至5.50，此后有所恢復，但一直低于6.5;而接種比為30%和40%時，雖然發酵液pH值第6 d出現檢測最低值，分別為6.02和6.15，但都能迅速恢復至7.0左右，并一直穩定在中性范圍。

丙酸、乙酸均為厭氧發酵中產生的主要揮發性脂肪酸種類，是由有機物料向沼氣轉化過程的重要中間產物，其濃度變化不但關系到反應器運行效率，而且是判斷體系是否穩定的重要標志之一[23-25]。有研究表明，過高的丙酸濃度會直接抑制產甲烷菌活動。關于丙酸抑制濃度閾值的報道各不相同，可能與原料種類、產甲烷菌類型、緩沖物質含量等諸多因素有關[26]。圖5、圖6展示了不同接種比條件下，發酵液中丙酸、乙酸的變化情況。與pH值變化趨勢相對應的是，各處理組在試驗初期，丙酸、乙酸濃度均出現快速上升過程，而高接種比條件下升幅更快，T1、T2、T3、T4處理組最高丙酸濃度分別為665.34、805.35、910.40、923.36 mg/L，最高乙酸濃度分別為742.14、1 006.08、1 303.64、1 314.42 mg/L;接種比20%、30%與40%處理組的丙酸在6 d后、乙酸在15 d后逐步下降，而10%處理組則基本維持不變。這可能是由于更多接種物雖然提供了較多的產酸微生物而產生揮發性脂肪酸，但是也能提供更多的產甲烷微生物消耗揮發性脂肪酸。

可見，高接種比條件下，雖然更多的微生物會較快地將大分子有機物分解為揮發性脂肪酸導致pH值下降，但是接種物中富含的產甲烷菌等也能更快地消耗有機酸產生甲烷，同時有更多的氨氮等緩沖物質產生，使得發酵體系pH值更加趨于中性并能保持穩定，因而更加有利于甲烷的產生。而接種物過少時，揮發性脂肪酸產生速度遠超過消耗速度，導致pH值逐漸降低后難以恢復，進而對產甲烷菌群造成毒害，形成負反饋效應，引起發酵體系崩潰，產氣停滯[27]。總體而言，較高的接種物含量是發酵體系pH值和揮發性脂肪酸保持動態平衡的重要保障。

2.4 不同處理氨氮濃度變化

厭氧沼氣發酵過程中氨氮的產生，主要是由于蛋白質、氨基酸、尿素等含氮有機物被微生物分解所致[28]。同pH值和揮發性脂肪酸類似，氨氮濃度須穩定維持在一定范圍內才能保證甲烷的順利產生。適當濃度的氨氮不但為沼氣微生物菌群的生長提供營養，而且可以對酸性物質起到良好的緩沖;氨氮過低則體系緩沖能力下降，而氨氮超量累積是厭氧發酵失衡的另一重要因素。任南琪[29]、Koster[30]等認為若氨氮濃度超過1 700 mg/L，則乙酸營養型產甲烷菌活動會受到很大抑制。本研究結果（圖7）表明，試驗周期內T1、T2、T3、T4處理組氨氮濃度均有所上升，各組氨氮濃度變化范圍分別為：152.45～213.87、165.29～372.90、184.38～972.45、198.20～1 010.21 mg/L。可見，隨接種物用量的增大，接種物中的分解菌群能夠更快地將物料中的含氮有機物降解為無機態的氨氮，從而提高發酵液中的氨氮濃度。而較高的氨氮濃度又可以及時中和部分揮發性脂肪酸，升高pH值，避免“過酸化”現象的不利影響，起到保護正常厭氧發酵順利進行的作用。同時，由于本研究中使用的發酵原料為葉菜類尾菜，蛋白質等含氮物質含量低，未觀察到明顯的由氨抑制引起的發酵停滯現象。

3 討論與結論

利用集約蔬菜產區豐富的葉菜類尾菜進行厭氧發酵獲取沼氣和有肥料利用價值的沼渣、沼液，是實現資源高效利用、促進農業可持續發展的重要方式。然而，由于葉菜類尾菜自身原料特點，極易在發酵中出現“過酸化”現象而導致產氣效率大大下降。“過酸化”現象出現的原因雖然是多方面的，但根本原因是沼氣微生物菌群不足以及時消耗迅速產生的揮發性脂肪酸，導致酸過量累積和pH值驟降超出微生物耐受閾值的負反饋效應。接種物中含有數量豐富、種類多樣的沼氣微生物菌群，是厭氧發酵中產甲烷菌群的唯一來源，而產甲烷菌通常生長代謝較為緩慢，是厭氧沼氣發酵的限速因素，其利用揮發性脂肪酸產生甲烷的效率直接決定了酸累積程度[31，32]。因此在厭氧發酵的起始階段增加接種物用量，迅速提高產甲烷菌數量，就有可能提高系統的有機酸分解能力、促進酸堿平衡進而提高產沼氣性能。Li[33]、Zhu[34]、Yang[35]等在研究不同農業廢棄物厭氧沼氣發酵時，均認為較高的接種比具有縮短反應器啟動時間、平衡酸堿、提高系統穩定性、增加沼氣產量等優勢。

然而，具體到每種不同種類的農業廢棄物，其最佳接種比可能存在很大不同。Lesteur等[36]研究指出，以不同物料、按不同工藝進行厭氧沼氣發酵時，揮發性脂肪酸的累積情況和系統緩沖能力均有可能差異巨大，需要通過試驗確定最佳接種比，才能保證產沼氣潛力的正常發揮。白菜、芹菜和萵苣等在種植和采收過程中會附帶產生大量的尾菜，這些尾菜含有糖類、蛋白質等營養物質，含水量高，“易分解”是其明顯區別于農作物秸稈、禽畜糞便等常見農業廢棄物的特征。比較而言，以葉菜類尾菜為主要原料的厭氧沼氣發酵更容易受到“過酸化”現象的危害，選擇合適的接種比是該類農業廢棄物能源化利用的關鍵點之一。

氨抑制是厭氧沼氣發酵中與“過酸化”相并列的另一類有害因素，高濃度的氨氮與揮發性脂肪酸一樣毒害沼氣微生物菌群，不利于系統酸堿平衡和產氣進行。但是，氨抑制一般發生在禽畜糞便、餐廚垃圾等蛋白質含量高的物料厭氧發酵過程中[37]。葉菜類尾菜蛋白質含量較低，發酵過程中一般不會形成氨抑制，此時較高濃度的氨氮反而可以中和揮發性脂肪酸，起到平衡酸堿的積極作用。采用較高的接種比時，數量更豐富的分解菌群能夠更快地水解原料產生氨氮，提高系統酸緩沖能力，有利于產甲烷菌等其它微生物生存、生長和正常發酵的進行。

本研究比較了10%、20%、30%和40%接種比條件下葉菜類尾菜厭氧發酵的情況，結果表明，不同接種比對葉菜類尾菜厭氧發酵產沼氣性能影響顯著。若接種比過低（10%和20%），則發酵中會出現丙酸乙酸大量累積、pH值驟降、酸堿平衡失調的“過酸化”現象，沼氣菌群失活或活性降低，無法保證正常的產甲烷過程;而較高的接種比（30%和40%）能夠維持發酵體系丙酸、乙酸、氨氮動態平衡和pH值相對穩定，避免發生“過酸化”現象，有利于沼氣菌群正常活動，確保甲烷順利產生。這同任海偉[12]、Li[33]、Zhu[34]、Yang[35]等的研究結果相一致。30%和40%接種比處理組最高沼氣日產量分別為2.95 L和3.17 L，累積產氣量分別為42.91 L和43.22 L，最高甲烷濃度分別為67.21%和67.33%，數值接近。因此，綜合產氣效率和經濟性角度考慮，30%的接種物濃度為本試驗的最佳接種比。

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