利用直擴PCR試劑盒檢測小麥多效抗病基因

李瑋 宋國琦 李玉蓮 張淑娟 張榮志 高潔 李吉虎 李根英

摘要：為了明確直擴PCR在小麥多效抗病基因檢測中的效果，促進廉價、快捷的直擴PCR技術在小麥分子育種中的應用，本研究通過對聚合三個多效抗病基因Sr2、Lr34、Lr67的BC2單株進行直擴PCR檢測，篩選到了三個基因聚合的雜合單株，證明了直擴PCR的有效性，并討論了直擴PCR的優缺點和影響因素，為直擴PCR技術在作物分子育種中的推廣應用提供參考。

關鍵詞：小麥;直擴PCR試劑盒;多效抗病基因;分子標記

中圖分類號：S512.1：Q781 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0015-04

Abstract To clarify the effect of direct PCR in detecting pleiotropic disease resistant genes in wheat， and promote the utilization of inexpensive and rapid direct PCR technology in wheat molecular breeding， the BC2 progeny were detected by direct PCR. The results showed that the heterogeneous individuals with three pleiotropic disease resistant genes Sr2， Lr34 and Lr67 were selected by direct PCR which indicated the effectiveness of direct PCR. The advantages， disadvantages and impact factors of direct PCR were also discussed. This study would provide references for popularization and application of direct PCR in crop molecular breeding.

Keywords Wheat; Direct PCR kit; Pleiotropic disease resistant gene; Molecular marker

小麥是我國第三大糧食作物，條銹病、葉銹病、稈銹病和白粉病是小麥生產中的重要病害，多效抗病基因對銹病和白粉病均有持久抗性，主要有Lr34/Yr18/Pm38/Sr57[1]、Lr27/Yr30/Sr2[2]、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58[3]和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55[4]。利用分子標記輔助將多效抗病基因導入優良品種培育抗病品種是防治病害經濟有效的途徑。開展分子標記輔助選擇育種需要提取DNA進行分子標記檢測，常用的DNA提取方法主要是CTAB法[5]和SDS法[6]，這兩種方法都需要經過組織破碎、細胞裂解、蛋白沉淀、DNA洗鹽和重新溶解等多個步驟，不但費時費力，而且DNA提取質量和數量不能保證。傳統的DNA提取方法耗時耗力，已成為分子標記檢測的限速步驟。

隨著研究的深入，科研人員發現導致PCR失敗的主要原因不是模板不足，而是PCR抑制因子太多[7]。通過改變DNA提取策略，使用極少量組織樣品或稀釋粗提液作為模板進行PCR反應（即直擴PCR）被提出并在法醫檢測中成功應用[8]。在植物方面，Berthomieu等最早在煙草中使用藍槍頭（1 mL）或黃槍頭（200 μL）穿刺葉片和根獲得少量組織碎片，加入100 μL PCR反應體系中獲得了直擴PCR成功[9];Rogers等用白槍頭（10 μL）擠壓葉片獲得小葉盤，加入50 μL PCR反應液中進行擴增，也獲得了成功[7]。Collard等比較了6種從水稻葉片中提取DNA的方法，發現堿法（以NaOH溶液為提取液）和傳統SDS法提取DNA的PCR擴增效果相當[10]。在小麥中，He等對Pm21進行基因定位時，采用TE煮沸法獲得粗提DNA直接進行PCR反應，也取得較好的效果[11]。

直擴PCR減少了繁瑣的DNA提取步驟，操作簡便，省時省力，特別適用于對大量個體的分子標記檢測，是簡便快捷的可選方法。鑒于直擴PCR在小麥中應用較少，為了明確直擴PCR在小麥分子育種中的效果，本研究利用直擴試劑盒對聚合三個多效抗病基因（Sr2/Lr34/Lr67）的小麥BC2單株進行分子標記檢測，成功篩選到同時含有三種基因的雜合單株，可為自交創制多效抗病基因聚合新種質提供材料，并為促進直擴PCR的廣泛應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用小麥材料為Pavon76（含Sr2）、中國春（含Lr34）、NP876（含Lr67）和濟麥229復交聚合三個多效抗病基因然后用濟麥229回交的BC2單株。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA粗提液準備 參考T5植物直擴試劑盒（擎科，青島）說明書中的加熱裂解法處理樣品。取苗期小麥葉片，剪取4 mm×2 mm大小放入1.5 mL離心管中，加入50 μL buffer A，用黃槍頭搗幾下使溶液變綠，95℃溫浴10 min，加入等體積buffer B，混勻后取上清1 μL作模板。

1.2.2 引物 試劑盒提供陽性對照引物rbcLa-F（5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3′）和rbcLa-R（5′-GAAACGGTCTCTCCAACGCAT-3′），用于擴增維管植物rbcL基因650 bp片段。選用cssfr1檢測Lr34[12]。選用csSr2檢測Sr2[13]，由于csSr2引物組合擴增不穩定，用DNAMAN8設計引物Sr2-637R（5′-CCCTGCTATCATCATAATCAGTC-3′）與原引物csSr2F組合進行檢測。TM4是Lr67的KASP標記[14]，利用dCAPS Finder 2.0[15]將TM4轉換成dCAPS標記TM4dcaps，用于檢測Lr67。

1.2.3 直擴PCR 采用10 μL體系，包含2×T5直擴酶Mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL（擎科，青島），DNA粗提液1 μL，去離子水3 μL。利用384孔PCR儀Veriti（AB，美國）進行PCR，程序為：98℃ 3 min; 98℃ 10 s，退火10 s（退火溫度：陽性對照64℃，cssfr1 58℃，csSr2 62℃，TM4dcaps 53℃），72℃ 10 s，40個循環;最后72℃ 3 min。

1.2.4 酶切反應 取5 μL dCAPS標記擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增成功的加入1×buffer R 1 μL，HinfⅠ（10 U·μL-1）1 μL，去離子水3 μL，混勻后37℃溫浴1 h。

1.2.5 產物檢測 PCR產物或酶切產物用1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，GoldView Ⅱ型核酸染料（索萊寶，北京）染色，Universal Hood Ⅱ（Bio-Rad，美國）拍照。PCR產物檢測用Marker DL2000（六條帶從大到小依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp），酶切產物檢測用50 bp DNA Ladder（八條帶從大到小依次為500、400、300、250、200、150、100、50 bp）。

2 結果與分析

2.1 陽性對照檢測結果

在獲得DNA粗提液后，首先利用試劑盒提供的陽性對照引物進行檢測，從結果（圖1）可見，所有個體均能擴增出650 bp條帶，說明粗提液可以用于后續實驗檢測。

2.2 Lr34檢測結果

Lr34的分子標記cssfr1是一個顯性標記，含有該基因的單株可擴增出517 bp條帶，而不含該基因的單株無該條帶（圖2）。在本研究中，BC1代時用隱性純和親本濟麥229對雜合型個體進行了回交，BC2個體能擴增出517 bp條帶即表明其為雜合型單株（下同）。擴增條帶的強弱可能與DNA粗提液的質量有關。

2.3 Sr2檢測結果

csSr2是CAPS標記，有三種檢測結果：無擴增（不含Sr2），有擴增但不能酶切（不含Sr2），有擴增可以酶切（含有Sr2）。在本研究中，由于僅供體親本Pavon76含有Sr2，其他親本均無，所以至BC2時，僅通過有無擴增產物即可判斷是否含有Sr2，不需要進行酶切。含有Sr2的單株（雜合型）可擴增出484 bp條帶，不含Sr2的單株無擴增（圖3）。

2.4 Lr67檢測結果

TM4dcaps擴增產物385 bp（圖4），用HinfⅠ酶切后，不含Lr67的單株產生329 bp條帶，含有Lr67的單株不酶切，雜合型單株同時含有385 bp和329 bp兩條帶（圖5）。

2.5 三個多效抗病基因的篩選結果

通過上述直擴PCR篩選，我們從8個BC2單株中篩選到了同時含有Lr34、Sr2和Lr67三個多效抗病基因的雜合單株1和3，成功篩選出目標。

3 討論

多效抗病基因是小麥寶貴的基因資源，利用分子標記輔助選擇進行回交轉育是利用這些寶貴資源的有效手段。直擴PCR作為一種分子標記檢測策略，已經在法醫數據庫建設中得到了廣泛應用[16]，將其用于小麥分子育種有助于改善當前分子標記檢測成本較高、耗時費力的現狀。與傳統的CTAB或SDS提取方法相比，直擴PCR采用DNA粗提液作為模板，其突出優勢表現在：僅需少量組織樣品，不需要液氮研磨，不需要離心，不需要氯仿、異丙醇等有機溶劑，無需更換離心管或深孔板，操作步驟少，節省大量時間。其缺點是DNA濃度太低，無法用電泳或紫外吸收法進行檢測，保存時間不長，樣品量太少用研磨儀打碎困難等。

直擴PCR的擴增效果受多種因素影響。利用粗提DNA進行直擴PCR時模板DNA少，對于低拷貝目標序列可能會失敗[9]。Rogers等對不同物種葉盤法直擴PCR的研究認為直擴PCR的效率在物種間存在差異，導致擴增失敗的原因不是模板量少，而是抑制物太多，使用更小的葉盤可以獲得較好的檢測效果[7]。Li等也認為組織樣品的多少是直擴PCR成功的關鍵，太多的組織會抑制擴增，在反應體系中加入硫酸銨可以增加引物退火的特異性，改善檢測效果[17]。用NaOH作為提取液的堿法獲得的粗提液，后續的稀釋起到關鍵作用[18]。在本研究中，陽性對照引物和TM4dcaps擴增效果較好，csSr2單株間擴增條帶強弱差異較大，cssfr1的擴增效果較差，說明引物的擴增效率對直擴PCR的效果也有影響。獲得足夠的DNA，降低抑制物的含量，是直擴PCR成敗的關鍵，不管是減少組織樣品量，還是稀釋粗提液，目前都存在個別樣品擴增效果不佳甚至失敗的問題。因此有必要進一步研究改進直擴PCR技術，為分子育種的高效率、低成本規模化應用提供技術支持。

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