煙草赤星病菌AabHLH1基因的克隆及功能分析

楊然 李珊珊 毛勝潔 劉琛 常秦 杜立家 徐后娟

摘要：堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子是真核生物中高度保守的一類轉錄因子，參與調控多種植物致病真菌的生長發育、外界脅迫應答反應和致病力等過程。本研究從煙草赤星病菌鏈格孢中克隆了一個bHLH1類型轉錄因子基因，命名為AabHLH1。該基因編碼區全長1 650 bp，無內含子，編碼蛋白含549個氨基酸。利用同源重組方法獲得了該基因的插入突變體M1，M1菌落在PDA上呈淺褐色，邊緣白色;氣生菌絲較野生菌株（WT）稍弱，鏡檢可見部分菌絲彎曲明顯，產孢量降低，且分生孢子萌發時間推遲，萌發率較WT降低56.12%;黑色素含量降低，毒素致病力明顯降低，致病性明顯減弱。由此可見，AabHLH1基因參與調控鏈格孢的生長、產孢和孢子萌發、黑色素和毒素產生以及致病性等過程。

關鍵詞：煙草赤星病菌;堿性螺旋-環-螺旋;轉錄因子;產孢;致病性

中圖分類號：S572.035.3：Q781 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）01-0024-07

Abstract Basic helix-loop-helix （bHLH） transcription factor is highly conservative in eukaryotes which regulated fungal growth and development， external stress responses， pathogenicity and other processes. In this study， a transcription factor gene of type bHLH1 was cloned from Alternaria alternata and named AabHLH1. It had a total length of 1 650 bp with no intron and encoded a protein with 549 amino acids. AabHLH1 insertion mutant was obtained by homologous recombination method and named M1. The colony of M1 was light brown with white edge， and the aerial hypha was slightly weaker than that of WT. Microscopic observation showed that the mycelia of M1 was sometimes curved. The spore yield of M1 reduced， and the spore germination time was delayed with the germination rate 56.12% lower of that of WT. The melanin content， toxin virulence and pathogenicity of M1 were also reduced significantly. It could be concluded that the AabHLH1 gene was involved in the regulation of colony growth， sporulation and germination， production of melanin and toxin， and pathogenicity.

Keywords Alternaria alternata; bHLH; Transcription factor; Sporulation; Pathogenicity

鏈格孢（Alternaria alternata）是一種在自然界中廣泛分布的真菌，其寄主范圍廣，對環境和基質的適應性強，既是重要植物病原菌又是常見的腐生菌。其侵染煙草引起的赤星病是煙草生產上一種重要的葉部病害，條件適宜時可引起暴發性危害，導致煙葉品質下降，香氣質差，香氣量少，刺激性和雜氣增加，已成為優質煙葉生產的一大障礙[1]。據報道，該病發生嚴重時對煙葉產量的損失可達到30%，而對產值損失率最高可以達到90%[2]。

堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子廣泛存在于動物、植物和真菌中，是真核生物中高度保守的一類轉錄因子，該類轉錄因子結構域含有兩個功能分化的區域——堿性區域（basic region）和螺旋-環-螺旋區域（helix-loop-helix，HLH）[3]。其中堿性區域位于N端，約10～15個氨基酸組成，對 DNA 結合起著重要作用[4];螺旋-環-螺旋區域由約40個氨基酸組成，其中環的長度在不同蛋白中不同[5]。在動物和植物中，已報道的bHLH轉錄因子多參與調控生長發育和細胞活性等過程[6，7]。在真菌中有關bHLH轉錄因子的研究，除了在稻瘟病菌[8]中有系統研究、曲霉屬7個bHLH轉錄因子基因功能[9]被報道外，在其它植物致病真菌中的報道較少，截止到目前鏈格孢尚未見bHLH家族轉錄因子的研究報道。

鏈格孢共有12個bHLH類型轉錄因子，本研究從鏈格孢菌中克隆并鑒定了bHLH1的同源基因并命名為AabHLH1，利用同源重組方法獲得了該基因的插入突變體，通過表型分析揭示了該基因與色素、菌絲形態、分生孢子產生、營養生長及致病性的調控關系，為闡明bHLH轉錄因子的功能提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、煙草品種和質粒

供試鏈格孢野生型菌株YS-16（Alternaria alternata YS-16），由本實驗室從煙草赤星病病葉上分離，并通過分子生物學鑒定。

供試煙草品種為紅花大金元，于山東農業大學溫室培養。

本試驗所用克隆載體pMD18-T購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，質粒pUCATPH和pCB1532由Dr. Baek（Yeungnam University）惠贈。

1.2 質粒、基因組DNA、RNA的提取及cDNA的合成

鏈格孢菌全基因組DNA的提取采用改良的CTAB法，參照張曉祥等[10]的方法。總RNA的提取使用Invitrogen公司的Trizol試劑盒，cDNA的合成利用Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA試劑盒（TaKaRa，中國）。質粒的提取參考生工生物工程（上海）股份有限公司的SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒。

1.3 AabHLH1基因的克隆及序列分析

以真菌轉錄因子數據庫中蕓薹生鏈格孢的bHLH轉錄因子基因AB10294（http：//ftfd.snu.ac.kr/tf.php？a=summary0_dv&ref_id=1257&spe_id=2780）為查詢序列，在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中查找鏈格孢的同源基因，并分別以YS-16的基因組DNA和cDNA為模板，進行PCR驗證。所用引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見表1。結構域預測采用 Smart Server （http：//smart.embl-heidelberg.de/）。

1.4 AabHLH1基因插入及回補

AabHLH1基因插入突變載體的構建參照Cho等[11]的線性最小元素法（linear minimum element，LME）。具體如下：以CF/CR為引物，以鏈格孢YS-16的基因組DNA為模板，PCR擴增316 bp片段;利用SacⅠ和KpnⅠ酶切該片段，連入同樣酶切的pUCATPH，得到AabHLH1基因的插入突變載體pUCATPH-AabHLH。以M13F/M13R為引物，以測序正確的pUCATPH-AabHLH為模板，PCR擴增得2 815 bp片段用于鏈格孢的原生質體轉化。

鏈格孢原生質體的制備、轉化參照Xu等[12]的方法，轉化子驗證采用PCR和Southern結合策略。

Southern blot分析：分別提取野生菌株和插入突變菌株的DNA，經限制性內切酶BamHⅠ酶切后進行凝膠電泳，以來自于質粒pUCATPH的引物Hph1/Hph2擴增產物為探針，分別進行Southern blot分析。Southern blot具體步驟參照羅氏DIG High Prime DNA標記及雜交檢測試劑盒Ⅱ說明書。

AabHLH1基因的回補利用CF/CR為引物，以YS-16的基因組DNA為模板，擴增AabHLH1基因編碼區以及自身啟動子區域片段（2 650 bp），酶切后該片段和帶有氯嘧磺隆抗性的質粒pCB1532進行T4連接，得到回補載體pCB1532-AabHLH1，測序正確后轉化到AabHLH1基因插入突變體的原生質體，利用200 μg/mL潮霉素B和5 μg/mL氯嘧磺隆進行初步篩選，并利用反轉錄PCR，以SF/SR為引物鑒定AabHLH1基因的表達。

1.5 AabHLH1基因插入突變體的生物學表型測定

1.5.1 菌落表型觀察及生長測定 分別從鏈格孢野生菌YS-16（WT）、AabHLH1基因插入突變體（M1）及其回補菌株（C1）的菌落邊緣取直徑9 mm的菌絲塊，接種到PDA和MM培養基上，置25℃光照培養箱內培養7 d，觀察菌落形態并測量菌落直徑。每個菌株設3個平行，試驗重復3次。

1.5.2 菌絲及孢子形態觀察 取25℃光照培養5 d的PDA和水瓊脂培養基的平板，在各試驗菌株菌落邊緣挑取少量菌絲分別制作玻片，顯微鏡下觀察菌絲及孢子的形態及孢子萌發情況。參照Gai等[13]的方法，計算各試驗菌株在水瓊脂培養基上的分生孢子產量。試驗重復3次。

1.5.3 黑色素含量測定 分別刮取在25℃、PDA平板上生長10 d的各試驗菌株菌絲0.25 g，參照楊一艷等[14]的方法，進行黑色素的提取和含量測定。菌絲中黑色素含量（y，mg/g）計算公式為：y=（x+0.0114）/0.0495，式中，x為459 nm處的吸光值。試驗重復3次。

1.5.4 毒素致病力測定 毒素的制備和致病力測定參照郭永峰[15]的方法，采用幼苗浸根法進行毒素致病力測定，以滅菌蒸餾水處理為對照。試驗重復3次。

1.5.5 致病性分析 采用離體葉片接種法進行不同菌株的致病性分析，分別在PDA上培養5 d的WT、M1和C1菌落邊緣打取直徑為9 mm菌碟，接種到清洗干凈的紅花大金元葉片上，28℃保濕光照培養，觀察葉片發病情況。每個菌株做3個重復。

2 結果與分析

2.1 AabHLH1基因克隆及生物信息學分析

通過PCR擴增獲得了AabHLH1基因的DNA和cDNA，測序結果顯示AabHLH1基因全長1 650 bp，無內含子，編碼一個含549個氨基酸的蛋白。系統進化樹顯示AabHLH1與番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）相似度最高（圖1）。

2.2 AabHLH1基因的敲除、鑒定及回補體的鑒定

AabHLH1基因突變載體pUCATPH- AabHLH1構建如圖2所示，即用限制性內切酶SacⅠ和KpnⅠ將AabHLH1基因編碼區316 bp片段進行雙酶切（圖2a），連入同樣酶切的質粒pUCATPH，得到pUCATPH-AabHLH1（圖2b）。

AabHLH1基因插入突變體的鑒定采用PCR和Southern blot相結合的方法進行，對4株轉化子進行PCR驗證，僅有1株（M1）可以擴增到目的條帶，大小分別為884 bp和2 254 bp（圖2c、圖2d），測序分析這兩個片段，證明同源重組發生。Southern blot結果（圖2e）顯示，M1的gDNA雜交后得到單一條帶，而WT則沒有，證明pUCATPH在轉化子中成功插入，且是單拷貝。

對M1回補的驗證采用RT-PCR方法，提取在潮霉素B和氯嘧磺隆雙篩選標記上生長的菌株，利用來自于AabHLH1基因的SF/SR為引物進行RT-PCR，結果（圖2f）表明成功擴增得到1 652 bp片段，測序正確，證明該基因成功表達。

2.3 菌落形態觀察及生長速度測定

在PDA上，鏈格孢WT氣生菌絲發達，菌落呈灰白色，而AabHLH1基因插入突變體M1氣生菌絲稍弱，菌落中間為淺褐色，邊緣白色;M1回補菌株C1基本恢復WT性狀。在MM上，和WT及C1相比，M1菌絲較稀疏，但菌落形態與WT和C1無明顯差異。生長速度分析顯示，AabHLH1基因缺失影響到菌落的生長，在PDA和MM上，M1菌落直徑比WT分別減少了15.21%和11.76%（圖3）。

2.4 菌絲、產孢和孢子萌發觀察

顯微觀察WT、M1和 C1的菌絲形態，結果如圖4（A）所示。在PDA和水瓊脂（WA）上， M1和WT類似，都出現了鏈格狀菌絲，但M1中部分菌絲出現彎曲現象，在WA中菌絲彎曲數量增多，程度增加。

進一步比對WT、M1和 C1的產孢量以及孢子萌發速度，結果如圖4（B）和表2所示。AabHLH1基因缺失影響到鏈格孢的產孢和孢子萌發過程，M1的孢子產量比WT和C1明顯減少，分別減少了50.31%和50.47%，孢子萌發率分別降低了56.12%和56.57%（表2）。而且M1的孢子萌發晚，速度低，WT在處理后4 h時大部分孢子都已萌發，而M1則未見孢子萌發;處理后8 h，M1始見萌發孢子，隨著處理時間延長至24 h，WT孢子萌發率達98%，而M1僅為43%?；匮a后萌發率回升，萌發缺陷消失，表明AabHLH1參與鏈格孢調控產孢及孢子萌發過程。

2.5 黑色素含量

分析了AabHLH1基因缺失對鏈格孢黑色素含量的影響，結果如表3所示。可以看出，突變體M1黑色素含量明顯降低，為3.644 mg/g，比WT降低了26.80%?；匮a菌株黑色素含量為4.998 mg/g，與野生菌無明顯差異。表明AabHLH1基因參與調控鏈格孢的黑色素合成。

2.6 毒素致病力

比較了AabHLH1基因插入突變體M1與WT、C1的毒素致病力差異，結果如圖5所示?？梢钥闯?，毒素處理1 d后，WT毒素浸根的煙苗開始發病，所有葉片均出現發黃現象，心葉蜷縮;而M1處理的煙苗葉片開始發黃，心葉開始萎蔫但沒有蜷縮;浸根2 d后，WT處理煙苗葉片蜷縮嚴重且全部變黃，根莖部發黑，而使用M1毒素浸根處理的煙苗僅出現葉片發黃現象，未見明顯葉片蜷縮及根莖部發黑現象。C1毒素處理煙苗和WT類似。表明AabHLH1參與調控鏈格孢的毒素產生過程。

2.7 致病性分析

進一步比較了突變體M1與WT以及C1的致病性，結果如圖6所示?？梢钥闯觯齻€菌株接種的煙葉均發病，但發病程度差別較大。在WT和C1接種的葉片上，接種菌落在接種點繼續擴大，氣生菌絲在葉片擴展，病斑蔓延至整個葉片區域;而M1接種后病斑區域較小，葉片發黃。由此可見，AabHLH1基因參與調控鏈格孢的致病性。

3 討論與結論

目前，關于真菌中bHLH轉錄因子的研究已有報道，但由于該類轉錄因子在不同真菌中數目不同，如在稻瘟菌中有9個bHLH轉錄因子[8]，鏈格孢中則有12個;且同一真菌中bHLH轉錄因子序列同源性較低，導致已經報道的該類轉錄因子功能差異較大。如在粗糙脈孢霉（N. crassa）中，轉錄因子CHC-1參與了CO2介導的產孢負調控過程，另外還調控了碳代謝、鞘脂合成、細胞壁合成和鈣信號傳導相關基因的表達[16]。在構巢曲霉（A.nidulans）中，Stu A調控分生孢子梗的形態、有性生殖及應激反應;AnBH1可能為致死基因，DevR是產生分生孢子所必需的[17]。在米曲霉（A. oryzae）中，SclR促進菌核的形成，且其編碼的蛋白質是維持米曲霉正常的菌株形態和細胞功能所必需的;EcdR與分生孢子梗早期分化有關，并且可以通過與SclR互作形成異二聚體影響彼此的功能[18]。本研究以鏈格孢bHLH轉錄因子家族的基因AabHLH1為對象，構建了AabHLH1基因的打靶載體，以PEG介導的原生質體轉化的方法進行轉化，成功篩選得到了AabHLH1基因插入突變體，并構建了回補體。與野生型鏈格孢相比，突變體菌落為淺褐色，氣生菌絲稍弱，生長速度較慢;鏡檢發現部分菌絲出現彎曲現象，孢子產量下降，萌發率降低，萌發時間推遲;黑色素含量降低;致病力明顯降低，推測AabHLH1突變體的產孢量顯著下降及孢子萌發率降低在一定程度上影響了病菌的侵染過程，造成了致病力減弱。有關AabHLH1基因對致病性的具體調控機制還有待進一步研究。

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