金納米電極對多巴胺和5-羥色胺的電化學富集和拉曼光譜檢測

楊丹 周晶 李語靜 趙銳 馮文南 何勁 王哲 楊國程

摘?要?對小分子神經遞質多巴胺（Dopamine，DA）和5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）的同時分析和檢測是生命科學領域中的研究熱點。單一的電化學檢測手段難以有效地識別分析物，因此，多模量的同時分析尤為重要。本研究在碳納米電極（Carbon-nanoelectrode nanopipette，CNE-NP）的基礎上，通過電化學反應在其尖端沉積金，構建了一種具有電化學特性和拉曼活性的雙功能金納米電極（Gold-nanoelectrode nanopipette，GNE-NP） 。經過交流介電泳（Dielectrophoresis，DEP）富集后，可用于對低濃度的DA和5-HT的檢測分析。研究結果表明，此電極實現了兩者的電化學響應的增強和區分。此外，引入的銀納米顆粒（AgNPs）作為拉曼增強因子和捕獲分析物的納米顆粒，同樣地經過DEP富集方法，使分析物的拉曼信號增強了2個數量級，且能對共混物進行特征峰的區分。將此電極應用于血漿樣品分析，可得到富集增強的電化學響應，但電化學響應會受到富集次數的限制。

關鍵詞?基于納米孔道的金納米電極;多巴胺;5-羥色胺;介電泳富集;表面增強拉曼光譜

1?引 言

在中樞神經系統中，多巴胺（DA）和5-羥色胺 （5-HT）是兩種重要的神經遞質[1]。其中，DA作為重要的兒茶酚胺類神經遞質分子，參與人體腦部工作和體液循環，是一種興奮神經的神經遞質[2];而5-HT多為抑制興奮的神經遞質[3]。由于DA和5-HT在生命體系統中是同時存在的，因此，二者的同時檢測并區分顯得尤其重要。目前，關于提高DA[4，5]和5-HT[6]檢測的選擇性和靈敏度的研究方法較多，其中，電化學技術由于具有簡單操作、高選擇性和高靈敏度等特點而得到廣泛的關注。

基于納米孔道（Nanopipette，NP）的納米電極在電分析檢測中具有獨特的優勢，近年來備受關注[7～9]。NP可用于制造成內壁/外壁金屬的[10，11]、內壁碳填充的[12]或者其它導電材料修飾的[13]等具有不同的功能和構造的納米電極，還可以通過電化學、光化學或者界面反應等進一步修飾[14～16]。盡管NP在環境檢測和掃描電化學顯微鏡等[8，17]領域的應用都取得了很大的進展，但對準確識別生物小分子，尤其是在人體樣品分析方面仍面臨著巨大的挑戰。近年來，已有許多關于生物小分子的電化學檢測的報道[18～20]，然而在體內和體外傳感中對各種神經遞質（如DA、5-HT、抗壞血酸、去甲腎上腺素等）的檢測，多集中在提高電化學信號的靈敏度以及特異性檢測的研究。這是由于神經遞質的釋放速度快，且在細胞外環境中的濃度低[1]，導致檢測到的電化學信號弱。雖然有多種方法可以提高這些具有電化學活性的小分子神經遞質在納米電極上的電化學響應[21，22]，但在同時測定這些神經遞質分子時，由于性質相近，電化學信號互相之間存在干擾[4]，通常需要對電極表面進一步修飾，才可以達到高靈敏度和特異性檢測的要求。同時，考慮到僅依靠單一的電化學信號無法獲取多種有用信息，而表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）作為一種精確的、無損傷的光譜技術，可以更好地輔助檢測和區分，實現無損檢測和分子官能團的確認。

本研究制備了一種基于NP的金納米電極（Gold nanoelectrode-nanopipette，GNE-NP），通過在納米電極尖端上電化學沉積金，使得納米電極同時具有電化學特性和拉曼活性。在本研究組之前的報道中[23，24]已經證明了基于NP的碳納米電極可以通過交流介電泳（Dielectrophoresis，DEP）富集方法，在電極尖端附近快速富集帶電荷的分子或納米顆粒，為增強DA和5-HT分子電化學信號和拉曼信號提供了有效的檢測手段。本研究結果將有助于更深入研究DA和 5-HT二者之間的電化學行為，并提供了有效增強電化學和拉曼光譜檢測信號的方法。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

CHI 852D電化學工作站（上海辰華公司）;SRS DS345函數發生器（美國斯坦福公司）;P-2000 CO2激光拉制儀、QF-100-7.5石英玻璃管（美國Sutter公司）;JEOL JSM-7610F掃描電鏡（日本電子公司）;LabRAM HR Evolution激光拉曼光譜儀（法國Horiba公司）;磁力加熱攪拌器（上海精密科學儀器有限公司）;燒制碳電極設備（自建）;500 mL丁烷氣瓶（純度99.9%），Φ 0.25 mm Ag/AgCl絲和Φ 0.5 mm的鉑絲（北京國藥試劑公司）。

四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O，上海麥克林公司）;三氯化六氨合釕（Ru（NH3）6Cl3）、鹽酸多巴胺（DA）、鹽酸5-羥色胺（5-HT）（Sigma Aldrich公司）;AgNO3、三水合檸檬酸三鈉（北京國藥試劑公司）;HCl、H2SO4（98%）、無水乙醇、H2O2（37%）、1×PBS溶液（pH=7.43）等試劑均為分析純;實驗用水均為Milli-Q超純水（18.2 MΩ·cm）。實驗所用血清由當地醫院提供。

2.2?實驗方法

2.2.1?金納米電極的制備與表征?（1）拉制納米孔道電極?石英管（長度7.5 cm，內徑0.5 mm，外徑1.0 mm）分別用Piranha洗液（H2SO4-H2O2，3∶1，V/V）、水、乙醇清洗，再用氮氣吹干，保持干燥。將石英管置于P2000拉制儀上拉制出兩根對稱的孔徑約100 nm的納米孔道電極，拉制參數如下：Heat=670;FIL=5;VEL=60;DEL=145;PUL=100。（2）燒制碳電極?參考文獻[23]的方法。在納米管內通入～30 kPa的丁烷氣體，并對準尖端進行高溫燒制，丁烷氣體通過高溫熱解會在石英管孔道內壁沉積碳，從而制備得到碳納米電極（Carbon nanoelectrode-nanopipette，CNE-NP）。最后，在碳納米電極的尖端利用電化學沉積金。Ag/AgCl絲為參比電極，鉑絲為對電極，鍍金溶液為1 mmol/L HAuCl4的PBS溶液，電沉積電位為70 mV，并控制沉積電流達到40 nA時停止電沉積。制備好的GNE-NP用水沖洗干凈，氮氣吹干。NP、CNE-NP及GNE-NP分別采用掃描電鏡進行形貌表征。（3）電化學檢測?采用循環伏安法（Cyclic voltammetry，CV）對GNE-NP電極鍍金前后的電化學性能進行對比。Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，1 mmol/L Ru（NH3）6Cl3作為電化學探針。循環伏安和差分脈沖伏安（Differential pulse voltammetry，DPV）檢測均在CHI 852D電化學工作站上進行，電流精度0.01 pA。