基于二氧化錳-氧摻雜氮化碳級聯催化的無酶比色檢測葡萄糖研究

朱巍然 郝楠 楊小弟 王坤

摘?要?基于二氧化錳（MnO2）-氧摻雜氮化碳（OCN）復合材料，構建了一種級聯催化無酶比色葡萄糖傳感器。通過在OCN的分散液中化學沉淀MnO2晶體制備得到MnO2-OCN復合材料。單體MnO2具有優異的類葡萄糖氧化酶活性，能夠催化葡萄糖分解產生H2O2，但類過氧化物酶活性較弱，無法充分消耗反應產生的H2O2。通過引入OCN，利用其優異的類過氧化物酶活性，可以顯著促進H2O2對底物的催化氧化，使溶液變色，顯著改善了對葡萄糖的檢測性能。基于MnO2-OCN復合材料構建的無酶比色傳感器擁有較寬的檢測范圍（0.05～2.00 mmol/L），檢出限為23 μmol/L（S/N=3）。將此傳感器用于血清樣品中葡萄糖的檢測，加標回收率為91.9%～94.3%。由于MnO2和OCN兩種材料對底物有較強的專一性，此傳感器特異性識別催化葡萄糖，特異性良好。

關鍵詞?二氧化錳;氧摻雜氮化碳;葡萄糖;比色法;無酶檢測

1?引 言

糖尿病已經成為當前影響人類健康最為嚴重的疾病之一[1]。人血液中葡萄糖含量是表征糖尿病的主要指標參數，因此，發展快速、靈敏、簡單的血液中葡萄糖含量檢測方法非常必要。目前，血糖檢測法包括高效液相色譜-電化學聯用法[2]、熒光法[3]和比色法[4]等。在這些檢測方法中，比色法因不需要昂貴儀器和復雜的檢測程序，以及可以現場診斷、裸眼識別結果等優勢而備受關注[5]。自納米酶的概念被提出以來[6]，因其不僅具備類似酶的催化能力，而且具有成本低、穩定性高，以及材料易于功能化等優點，已被廣泛應用于葡萄糖的比色檢測[7，8]。但是，因為具有類葡萄糖氧化酶活性的納米酶種類較少，目前的檢測體系多是將具有類過氧化物酶活性的納米酶材料和天然葡萄糖氧化酶（GOx）相結合，未徹底擺脫對天然酶的依賴，以及克服天然酶的局限[9，10]。因此，開發同時具有類葡萄氧化酶和過氧化物酶活性的納米酶材料，實現對葡萄糖的無酶檢測，具有重要的意義。

MnO2納米材料由于其獨特的材料性能，尤其是優異的類葡萄糖氧化酶活性而備受關注[11，12]。MnO2納米材料的晶體相和表面形貌是影響催化性能的兩個重要因素，研究者對MnO2的晶體和形貌的調控進行了大量研究[13，14]。最近，Han等[15]以牛血清蛋白（BSA）為模板，制備出同時具有葡萄糖氧化酶和過氧化物酶活性的MnO2材料，實現了葡萄糖的無酶檢測，但該材料的催化活性并不理想。通過與其它材料（如碳基材料或金屬氧化物）混合，可進一步提高MnO2的催化性能[16，17]。本研究組制備的氧摻雜氮化碳（OCN）表現出優異的類過氧化物酶活性，其二維平面結構和含氧官能團[18]也有利于負載MnO2。將這兩種材料進行結合，有望顯著改善對葡萄糖的催化檢測性能。

本研究通過將具有類葡萄糖氧化酶活性的MnO2與具有類過氧化物酶活性的OCN結合，構建了級聯催化無酶比色傳感器，用于葡萄糖的檢測。通過引入OCN，利用其優異的類過氧化物酶活性，可以促進H2O2對底物的氧化變色，顯著改善對葡萄糖的催化性能，實現了對葡萄糖的快速靈敏檢測。由于構成此傳感器的兩種材料對底物有較強的專一性，可以選擇性地識別葡萄糖和過氧化氫分子，故可以實現對樣品中葡萄糖的特異性檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

XRD-6100 X射線衍射光譜儀、UV-2450 紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）;TECNAI 10 透射電子顯微鏡（荷蘭Philips公司）;VG Multilab 2000 X射線光電子能譜儀（美國Thermo Scientific公司）。

D-（+）葡萄糖（≥ 99%，美國Sigma Aldrich公司）;3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（≥ 99%，TMB，上海阿拉丁公司;其它試劑至少為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，Direct-Q UV超純水儀，Millipore公司）;緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4）。

2.2?二氧化錳-氧摻雜氮化碳（MnO2-OCN）復合物的制備

OCN按本研究組報道方法制備[18]。將OCN在水中超聲分散，然后將2 mL（0.1 mmol/L）MnAc2溶液滴加到5 mL（1 mg/mL）OCN的分散液中，室溫振蕩1 h，使Mn2+與OCN充分結合;最后用1 mol/L NaOH調節至pH 10，室溫振蕩7 h。反應結束后，產物經離心、水洗和干燥后，得到復合物MnO2-OCN，于4℃ 保存。

2.3?葡萄糖的分析檢測

室溫條件下，向2 mL的離心管中分別加入20 μL MnO2-OCN分散液、50 μL葡萄糖溶液、400 μL PBS溶液（0.1 mol/L，pH 4.0），渦旋振蕩1 min，37℃下反應10 min。反應結束后，加入30 μL TMB溶液（8 mmol/L），40℃反應10 min。13000 r/min離心5 min，測定上清液在650 nm處的吸光值，按照標準曲線計算濃度。

3?結果與討論

3.1?OCN 和 MnO2-OCN的表征

OCN和MnO2-OCN的透射電子顯微鏡（TEM）圖如圖1A和1B所示，OCN呈片狀二維薄層結構（圖1A）;粒徑約3～5 nm的MnO2納米晶均勻地分布在OCN二維薄層表面（圖1B）。制備的OCN、MnO2和MnO2-OCN納米材料的X-射線衍射（XRD）圖譜見圖1C，對比發現，MnO2-OCN（曲線c）中分別在27.3°和22.5°兩處出現了對應于OCN和MnO2晶體的特征衍射峰，表明MnO2-OCN已成功制備。

XPS分析結果證實了MnO2-OCN中包含4種元素Mn、O、C和N（圖2A）。圖2B是Mn 2p峰的分峰擬合曲線，其中，653.9 eV處的峰歸屬于Mn 2p1/2的特征峰，643.4 eV和642.2 eV處的兩個峰均歸屬于Mn 2p3/2的特征峰，這與文獻[19，20]報道MnO2的XPS圖譜一致，證明在MnO2-OCN復合物中，MnO2是Mn元素存在的唯一形式。另一方面，在圖2C中，C 1s的寬峰被分成5個峰，歸屬于4個含碳官能團和碳污染[21～23];O 1s的XPS圖譜（圖2D）對應3種含氧官能團[24，25]，與本研究組之前的研究[18]吻合。XPS的結果進一步說明，本研究成功制備了MnO2-OCN復合材料。

3.2?材料的催化性能研究

以500 μL 50 μmol/L葡萄糖溶液為催化底液，TMB為顯色探針，對比研究了OCN、MnO2和MnO2-OCN對葡萄糖的催化活性。如圖3插圖所示，加入OCN后的底液為無色的溶液（插圖a）;加入MnO2后，底液由無色透明變為淡藍色（插圖b）;而加入MnO2-OCN后，底液則呈現更深的藍色（插圖c），

系列顏色的差異應歸因于TMB被氧化后產生的藍色氧化態TMB （oxTMB）量的不同。吸收光譜（圖3）結果表明，隨著不同材料的加入，650 nm處oxTMB的特征吸收峰的吸收強度差異明顯，表明OCN幾乎對葡萄糖的氧化無催化作用，而MnO2和MnO2-OCN均呈現催化葡萄糖氧化的能力。研究表明[15]，MnO2本身是一種葡萄糖氧化的級聯催化劑（如反應（1）和（2）所示），而OCN的引入進一步增強了MnO2的催化能力。因為OCN是一種具有優異的類過氧化物酶活性，但不具備類葡萄糖氧化酶活性的納米酶，因此復合材料級聯催化能力的顯著提升可歸因于對反應（2）的加速。這也說明了單體MnO2的類葡萄糖氧化酶活性較好，但類過氧化物酶活性較弱，不能充分利用反應（1）中生成的H2O2，而OCN的引入可以明顯促進反應（2）中H2O2催化TMB氧化變色，使底物溶液的顏色加深。

3.3?檢測條件的優化

反應條件對MnO2-OCN復合材料的級聯類酶活性的影響顯著，因此，對反應時間、反應溫度、TMB濃度和pH值進行了優化。如圖4所示，當溶液的pH=4.0時，底物溶液的吸收峰強度最大（圖4A）。在20～60℃范圍內，復合材料的催化活性在40℃時達到峰值（圖4B）。由反應時間與吸收峰強度的關系可知，在反應10 min后，反應速度減慢（圖4C），因此選擇10 min作為催化顯色的反應時間。綜合考慮檢測效果和試劑消耗，選擇TMB的濃度為8 mmol/L（圖4D）。

3.4?葡萄糖檢測

基于MnO2-OCN復合材料的高催化活性，在優化的實驗條件下測定葡萄糖。如圖5A所示，葡萄糖濃度與650 nm處的吸光度在0.05～2.00 mmol/L范圍內呈良好的線性關系（R2 = 0.9923），檢出限（S/N=3）為23 μmol/L。根據米氏方程，計算得到MnO2-OCN催化氧化葡萄糖的米氏常數Km=0.21 mmol/L，表明此復合材料對葡萄糖有較高的親和力。將本方法與文獻報道的葡萄糖比色檢測方法的分析性能進行比較（表1）可知，本方法的線性范圍較寬，檢出限較低。選擇常見的共存物質果糖、乳糖、麥芽糖，考察反應的特異性，結果如圖5B所示，10倍濃度的干擾物的響應信號遠低于葡萄糖的響應信號，表明本方法對葡萄糖的檢測具有高選擇性。

3.5?血清中葡萄糖的檢測

為了探究MnO2-OCN復合材料在實際生物樣品中的適用性，采用本方法測試了人體血清中的葡萄糖濃度。血清中葡萄糖的標準加入實驗結果如表2所示，加標回收率在91.9%～94.3%之間。在檢測血清中葡萄糖時，此傳感器表現出較高的精確性，可望用于實際樣品中葡萄糖的檢測。

4?結 論

采用簡單方法制備了同時具有類過氧化物酶活性和類葡萄糖氧化酶活性的MnO2-OCN復合材料，構建了級聯催化無酶比色葡萄糖傳感器。將MnO2與OCN復合，利用OCN優異的類過氧化物酶活性，顯著改善了對葡萄糖的催化性能。由于兩種材料對底物催化的專一性，即MnO2選擇性催化氧化葡萄糖，OCN選擇性催化葡萄糖的氧化產物H2O2氧化TMB，此復合材料對于葡萄糖的檢測具有較高的選擇性。本研究為葡萄糖的無酶檢測提供了一種簡單有效的方法。

References

1?Wild S，Roglic G，Green A，Sicree R，King H. Diabetes Care，2004，27（5）： 1047-1053

2?Prunty H，Manwaring V，Bainbridge K，Burke D，Finnegan N，Franses R，Lam A，Vellodi A，Heales S. J. Inherit.Metab. Dis.，2012，35： 369

3?Liu B W，Sun Z Y，Huang P J J，Liu J W. J. Am. Chem. Soc.，2015，137（3）： 1290-1295

4?Lu C，Liu X J，Li Y F，Yu F，Tang L H，Hu Y J，Ying Y B. ACS Appl. Mater. Interfaces，2015，7（28）： 15395-15402

5?Song Y J，Wei W L，Qu X G. Adv. Mater.，2011，23（37）： 4215-4236

6?Manea F，Houillon F B，Pasquato L，Scrimin P，Zhang Y. Angew. Chem. Int. Ed.，2004，43（45）： 6165-6169

7?Zhu J L，Peng X，Nie W，Wang Y J，Gao J W，Wen W，Selvaraj J N，Zhang X H，Wang S F. Biosens. Bioelectron.，2019，141： 111450

8?Sun J H，Li C Y，Qi Y F，Guo S L，Liang X. Sensors，2016，16（4）： 584

9?Lin T R，Zhong L S，Wang J，Guo L Q，Wu H Y，Guo Q Q，Fu F F，Chen G N. Biosens. Bioelectron.，2014，59： 89-93

10?Chen J，Chen Q，Chen J Y，Qiu H D. Microchim. Acta，2016，183（12）： 3191-3199

11?Yang X J，Tang W P，Feng Q，Ooi K. Cryst. Growth Des.，2003，3（3）： 409-415

12?Zheng D S，Yin Z L，Zhang W M，Tan X J，Sun S X. Cryst. Growth Des.，2006，6（8）： 1733-1735

13?Robinson D M，Go Y B，Mui M，Gardener G，Zhang Z，Masterogiovanni D，Garfunkel E，Li J，Greenblatt M，Dismukes G C. J. Am. Chem. Soc.，2013，135（9）： 3494-3501

14?Pokhrel R，Goetz M K，Shanker S E，Wu X，Stahl S S. J. Am. Chem. Soc.，2015，137（26）： 8384-8387

15?Han L，Zhang H J，Chen D Y，Li F. Adv. Funct. Mater.，2018，28（17）： 1800018

16?Zhang Z X，Li Z F，Sun C Y，Zhang T W，Wang S W. Catal. Today，2017，298： 241-249

17?Li P C，Hu C C，You T H，Chen P Y. Carbon，2017，111： 813-821

18?Zhu W R，Hao N，Lu J W，Dai Z，Qian J，Yang X D，Wang K. Chem. Commun.，2020，56： 1409-1412

19?Han L，Shao C X，Liang B，Liu A H. ACS Appl. Mater. Interfaces，2016，8（22）： 13768-13776

20?Pinaud B A，Chen Z B，Abram D N，Jaramillo T F. J. Phys. Chem. C，2011，115（23）： 11830-11838

21?Rong M C，Lin L P，Song X H，Zhao T T，Zhong Y X，Yan J W，Wang Y R，Chen X. Anal. Chem.，2015，87（2）： 1288-1296

22?Xiang Q J，Yu J G，Jaroniec M. J. Phys. Chem. C，2011，115（15）： 7355-7363

23?Li H J，Sun B W，Sui L，Qian D J，Chen M. Phys. Chem. Chem. Phys.，2015，17（5）： 3309-3315

24?Li J H，Shen B，Hong Z H，Lin B Z，Gao B F，Chen Y L. Chem. Commun.，2012，48（98）： 12017-12019

25?Zhang S，Liu Y，Gu P C，Ma R，Wen T，Zhao G X，Li L，Ai Y J，Hu C，Wang X K. Appl. Catal. B，2019，248： 1-10

26?Jabariyan S，Zanjanchi M. A，Arvand M，Sohrabnezhad S. Spectrochim. Acta A，2018，203： 294-300

27?Karim M N，Anderson S R，Singh S，Ramanathan R，Bansal V. Biosens. Bioelectron.，2018，110： 8-15

28?Yee Y C，Hashim R，Mohd Yahya A R，Bustami Y. Sensors，2019，19（11）： 2511