“細胞工廠”制備N-乙酰氨基葡萄糖研究進展

祁康 陳建華

摘要：N-乙酰氨基葡萄糖（（N-acetylglucosamine，GlcNAc）作為一種功能性糖，能夠發揮許多重要的生理功能，在醫藥、食品工業以及化妝品等行業具有廣泛的應用。隨著人們環境保護意識的日益增強以及合成生物學的蓬勃發展，針對GlcNAc制備方法不斷推陳出新，本文對此進行總述。

關鍵詞：N-乙酰氨基葡萄糖;合成生物學;制備

GlcNAc是氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的衍生物，分子式C8H15NO6，系統命名為2-（乙酰基氨基）-2-脫氧-D-葡萄糖。目前，GlcNAc制備方法中比較成熟且大規模應用到工業上主要是化學法。由于GlcNAc是多種甲殼類動物（螃蟹和蝦為主）表皮中甲殼素的基本成分，常利用強酸（包括鹽酸和硫酸）水解貝殼獲得不同形式的GlcN。但受限于原材料以及大量強酸使用對環境的損害，該方法顯然不可持續。

隨著代謝工程以及合成生物學技術的蓬勃發展，人們可以通過合理的規劃設計，利用“細胞工廠”制備所需化合物。文獻中已經大量報道利用不同微生物作為“細胞工廠”制備GlcNAc，具體指以廉價的葡萄糖作為碳源，通過微生物發酵制備所得。因其高效、環保和可持續，表現出良好的應用前景。

（1）大腸桿菌制備GlcNAc

生物法制備GlcNAc的研究首先在大腸桿菌中進行，大腸桿菌作為一種模式菌株，其遺傳背景是清晰的。Deng等人[1]首先通過過表達來自大腸桿菌自身氨基葡萄糖合酶基因（glmS）和來自釀酒酵母的N-乙酰氨基葡萄糖合酶基因（gna1），增強GlcNAc合成途徑。接著利用易錯PCR篩選出不受產物GlcN-6-P抑制的Glms突變體。又進一步敲除負責胞內GlcNAc降解途徑的關鍵基因（nagA/nagB）以及將GlcN/GlcNAc從胞外重新轉運至胞內的nagE和manXYZ基因。在1L發酵罐中產量達到了110g/L。隨后的研究發現，對糖酵解途徑關鍵酶之一的丙酮酸激酶編碼基因 pykA和pyk F分別敲除，都能夠有利于產量的提高，pyk F效果更明顯。但同時敲除pykA和pyk F，產量下降明顯。可能是因為丙酮酸激酶作為糖酵解途徑關鍵調控之一，完全阻斷會影響菌體生長，從而最終影響產量[2]。

（2）枯草芽孢桿菌制備GlcNAc

因大腸桿菌為非安全菌株，同時易受噬菌體侵染。研究人員又將目光轉向了遺傳背景清晰且作為安全菌株的枯草芽孢桿菌。劉龍等[3]首先共過表達了來源釀酒酵母的gna1基因和枯草芽孢桿菌自身的glmS基因，增強GlcNAc的合成途徑。隨后，同樣敲除nagP基因（編碼GlcNAc特異性的磷酸轉移酶系統）、nagA基因（編碼GlcNAc-6-P脫乙酰酶）和gamA/nagB基因（編碼GlcN-6-P脫氨酶）。進一步采用模塊代謝分析法將相關代謝通路分成三個模塊，即GlcNAc合成途徑、糖酵解途徑和肽聚糖合成途徑。利用干擾技術弱化糖酵解途徑和肽聚糖合成途徑的關鍵基因表達，使得更多碳源流向GlcNAc合成途徑。[4]此外，利用啟動子工程對glck基因（編碼葡萄糖激酶）和pgi基因（編碼磷酸葡萄糖異構酶）進行一系列組合優化[5];對相關副產物（包括乳酸、乙酸以及乙偶姻[6]）代謝途徑的阻斷，這些做法都能促進GlcNAc產量的提高。

（3）其他微生物制備GlcNAc

除了上述最常用的“細胞工廠”，還研究了利用工業上大規模發酵生產氨基酸的谷氨酸棒桿菌制備GlcNAc。谷氨酸棒桿菌在食品安全指標上更有優勢，代謝路徑也比較簡單。劉龍等[7]在谷氨酸棒桿菌S9114中過表達自身的glms基因和來自秀麗隱桿線蟲的GNA1基因;敲除編碼GlcNAc-6-P脫乙酰酶的nagA基因和編碼GlcN-6-P脫氨酶的gamA基因，以阻斷GlcNAc在胞內的代謝;敲除編碼乳酸脫氫酶的ldh基因，以阻斷副產物乳酸合成途徑。最終，GlcNAc的產量達到了6.9g/L。

展望

N-乙酰氨基葡萄糖作為一種具有重要生理作用的單糖，其在醫藥和化妝品行業被廣泛應用。受到當前人口老齡化日益嚴重以及對化妝品需求不斷增加的影響，人類對GlcNAc的需求也將不斷增加。化學法制備GlcNAc雖能大規模生產，但其對環境危害嚴重，與現今可持續發展理念背道而馳。顯然，利用“細胞工廠”制備GlcNAc具有更加高效、更加環保和更加可持續等優點。在各種“細胞工廠”中，已被認定為安全菌株的枯草芽孢桿菌可能更具應用前景。在接下來的研究，應將重點放在如何提高產量以期達到大規模量產的水平。

[參考文獻]

[1]Deng M D， Severson D K， Grund A D， et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine [J]. Metab Eng， 2005， 7（3）： 201-14.

[2]陳欣. 代謝工程改造大腸桿菌發酵生產氨基葡萄糖及過程優化與控制 [D]; 江南大學， 2012.

[3]Liu Y， Liu L， Shin H-d， et al. Pathway engineering of Bacillus subtilis for microbial production of N-acetylglucosamine [J]. Metabolic Engineering， 2013， 19（107-15）.

[4]Liu Y， Liu L， Shin H D， et al. Pathway engineering of Bacillus subtilis for microbial production of N-acetylglucosamine [J]. Metab Eng， 2013， 19（107-15）.

[5]Ling M， Liu Y， Li J， et al. Combinatorial promoter engineering of glucokinase and phosphoglucoisomerase for improved N -acetylglucosamine production in Bacillus subtilis [J]. Bioresource Technology， 2017， 245.

[6]Ma W， Liu Y， Shin H-D， et al. Metabolic engineering of carbon overflow metabolism of Bacillus subtilis for improved N-acetyl-glucosamine production [J]. Bioresource Technology， 2017， 250.

[7]Deng C， Lv X， Liu Y， et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum S9114 based on whole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis [J]. Synthetic and Systems Biotechnology， 2019， 4（3）： 120-9.

（作者單位：中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009）