生物胺降解菌株的篩選與鑒定

杜 雪 妥彥峰

(大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034)

生物胺是由相應的氨基酸經(jīng)脫羧作用產(chǎn)生，是維持正常生理功能的必需物質(zhì)，但攝入過量會導致頭暈、嘔吐、高血壓等不良癥狀，危害身體健康[1]。發(fā)酵豆制品、魚類制品、乳制品中均有生物胺存在[2]。目前，常用的控制生物胺的手段主要是通過控制產(chǎn)品生產(chǎn)溫度、pH值、鹽濃度[3]，或者使用輻照[4]等方法。但此方法會在一定程度上影響產(chǎn)品品質(zhì)，利用生物胺脫羧酶活性較低或者具有生物胺氧化酶活性的菌株作用發(fā)酵劑發(fā)酵食品，可以控制發(fā)酵食品中的生物胺含量[5-6]。鄧紅梅等[7]從發(fā)酵香腸中分離得到了具有生物胺減少能力的模仿葡萄球菌，該菌可降低MRS培養(yǎng)液中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺及酪胺含量。吳燕燕等[8]從咸魚中分離獲得了能夠降解腐胺、尸胺、組胺、酪胺的鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌。

試驗擬以實驗室保藏的疑似乳酸菌株為試驗菌株，篩選出能降低培養(yǎng)液中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺含量的菌株，并測定該菌株的生長曲線、耐鹽性以及不同pH值下的生長能力，旨在為控制發(fā)酵食品中生物胺含量提供備選菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

疑似乳酸菌菌株：分別從東北傳統(tǒng)大醬、新疆發(fā)酵酸奶以及嬰兒糞便中分離得到，共121株，大連工業(yè)大學大連市益生菌功能特性研究重點實驗室。

1.2 主要試劑

20%氨水：分析純，天津大茂化學試劑廠；

無水碳酸鈉：分析純，天津市瑞金特化學品有限公司；

色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺：色譜純，源葉生物試劑有限公司；

丹磺酰氯、乙腈：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；

MRS培養(yǎng)基：北京陸橋技術股份有限公司；

正己烷：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

三氯乙酸：分析純，阿拉丁生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

pH計：S210-K型，瑞士METTLER TOLEDO公司；

冷凍離心機：FS-1C-50型，德國HERMLE Labortechnik GmbH公司；

恒溫振蕩器：DKZ型，上海一恒科技有限公司；

數(shù)控超聲清洗儀：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

微生物培養(yǎng)箱：DNP-9082型，上海精密實驗設備有限公司；

液相色譜儀：S6000型，廣東華普科技股份有限公司；

酶標儀：Multiskan FC型，美國Thermo公司；

全自動生長曲線分析儀：Bioscreen C型，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 生物胺降解菌株的篩選 參照吳燕燕等[8]的方法并修改。將菌株活化3代，按2%接種量接種至pH 5.5，含8種生物胺的30 mL MRS培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，以未接種的MRS培養(yǎng)基為對照，4 000 r/min離心10 min，測定上清液中生物胺含量，并按式(1)計算降解率。

(1)

式中：

A——生物胺降解率，%；

ω——對照組生物胺含量，mg/kg；

ω1——處理組生物胺含量，mg/kg。

1.4.2 生物胺的測定 參照文獻[9-10]的方法并進行修改。

(1) 生物胺標準品的制備：準確稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺各10 mg，用0.1 mol/L HCl定容至100 mL，分別制備成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0，50.0 mg/L系列濃度的生物胺標準溶液。

(2) 樣品衍生化：取1.4.1中離心后的菌液750 μL于2 mL EP管中，加入150 μL飽和碳酸鈉溶液和750 μL丹磺酰氯，震蕩混勻，45 ℃水浴30 min，加入150 μL氨水，混勻，再加入200 μL乙腈，混勻，離心，過0.22 μm濾膜，待測。

(3) 高效液相色譜(HPLC)分析：HPLC洗脫梯度如表1 所示。流動相A為水，流動相B為乙腈；色譜柱為華普C18柱(250 mm×4.6 mm×5.0 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積20 μL；紫外檢測波長235 nm。

表1 HPLC洗脫梯度

1.4.3 生物胺降解菌株鑒定 根據(jù)細菌16S rDNA序列的V3-V4區(qū)設計引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。通過PCR擴增進行16S rDNA序列分析(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.4.4 生物胺降解菌株生長曲線 將菌株HM22、HM24、YF10042接種至MRS培養(yǎng)基中，全自動生長曲線分析儀培養(yǎng)溫度37 ℃，每隔2 h測定菌株培養(yǎng)液在600 nm處吸光度值，繪制生長曲線[11]。

1.4.5 生物胺降解菌株的耐鹽性能 參照徐鑫等[12]的方法并修改，MRS培養(yǎng)液中NaCl濃度分別為0%，2%，4%，6%，8%，10%，121 ℃滅菌20 min。將篩選出的3株菌株接種至含不同NaCl濃度的無菌MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定菌液在600 nm處吸光度值。以乳酸菌接入不含NaCl的MRS培養(yǎng)液為對照組；未接種乳酸菌的對應鹽濃度的MRS培養(yǎng)液為空白組。按式(2)計算抑制率。

(2)

式中：

ω——抑制率，%；

A0——空白組OD600nm值；

A1——對照組OD600nm值；

A2——處理組OD600nm值。

1.4.6 pH值對生物胺降解菌株生長能力的影響 將3株菌株分別接種至pH值為3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定OD600 nm，以不接種任何乳酸菌的各種pH的培養(yǎng)液為空白，以OD600 nm值評價其耐酸能力[13-14]。

1.4.7 統(tǒng)計分析 所有指標均重復測定3次，采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，比較各數(shù)據(jù)間的顯著差異性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物胺標準圖譜及標準曲線

由圖1可知，8種生物胺在35 min內(nèi)能很好地分離，并依此確定了各生物胺標準品的保留時間，說明此方法具有良好的分離檢測生物胺的效果。

1. 色胺 2. 苯乙胺 3. 腐胺 4. 尸胺 5. 組胺 6. 酪胺 7. 精胺 8. 亞精胺

圖1 生物胺混合標品HPLC色譜圖

Figure 1 HPLC chromatogram of biogenic amine mixed standard

由表2可知，8種生物胺的峰面積與其濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)均>0.998 0，說明采用HPLC法對于定量測定樣品中生物胺具有良好的可靠性[15]。

2.2 生物胺降解菌株的篩選

由圖2可知，菌株HM24和4-6對精胺的降解率達50%以上；菌株YF10042和HM24對亞精胺的降解能力>30%；菌株YF10042、HM24及HM22對色胺的降解能力>20%；菌株HM24對組胺的降解能力為(22.54±2.64)%，顯著高于其他菌株；菌株YF10042、HM24及HM22對苯乙胺的降解能力均>20%，其中菌株HM24對苯乙胺的降解能力達(35.75±2.71)%；菌株YF10042、HM24及HM22對8種生物胺均有降解作用，且對色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺和組胺的降解率顯著高于其他菌株，同時對酪胺、精胺和亞精胺的降解率也較高，均高于鄧紅梅等[6]的研究結(jié)果，故選取菌株YF10042、HM24和HM22進行后續(xù)試驗。

表2 8種生物胺回歸方程及相關系數(shù)

2.3 生物胺降解菌株的鑒定

將篩選出的菌株HM22、HM24和YF10042在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，其菌落形態(tài)和經(jīng)革蘭氏染色的菌體特征[16]如表3所示。

表3 菌落形態(tài)與菌體形態(tài)

將篩選得到的菌株按《乳酸菌分離鑒定及其試驗方法》的方法進行生理生化鑒定，將試驗結(jié)果與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行對比[17](表4)，初步判斷菌株HM22為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，菌株HM24為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，菌株YF10042為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。

由表5、圖3可知，菌株HM22與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)的同源性為99%，將其命名為發(fā)酵乳桿菌HM22；菌株HM24與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性為100%，將其命名成植物乳桿菌HM24；菌株YF10042與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的同源性為100%，將其命名為糞腸球菌YF10042。

表4 生理生化試驗結(jié)果?

? “+”為陽性；“-”為陰性；“d”為遲緩反應。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 生物胺降解菌株的生長曲線

由圖4可知，菌體在4 h時生長迅速，OD值顯著上升，為對數(shù)生長期；10 h后生長緩慢，進入穩(wěn)定生長期。

2.5 生物胺降解菌株的耐鹽性能

由圖5可知，當鹽濃度為2%～4%時，菌株YF10042的生長能力無顯著差異；當鹽濃度為6%時，菌株YF10042的生長受到了一定的抑制；當鹽濃度為10%時，菌株YF10042的抑制率為68.30%。隨著鹽濃度的增加，菌株HM22的耐受能力顯著下降，當鹽濃度為10%時仍有一定的耐受性；菌株HM24的抑制率逐漸增大，當鹽濃度為6%時其生長受到了抑制，當鹽濃度為10%時仍有一定的耐受能力。表明菌株對NaCl有一定的耐受能力，有利于菌株在高鹽發(fā)酵食品中生長繁殖，為控制高鹽發(fā)酵食品中生物胺含量奠定了基礎[18]。

表5 生物胺降解菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果

圖3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 生物胺降解菌株的生長曲線

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6 pH值對生物胺降解菌株生長能力的影響

由圖6可知，菌株HM22的最佳生長pH為4.5～6.5，菌株HM24的最佳生長pH為5.5，菌株YF10042的最佳生長pH為4.5；當pH為3.5時，3株菌株仍具有很好的生長能力，菌株HM24的生長能力弱于HM24和YF10042。當pH為9.5時，菌株HM24的生長能力強于其他兩株菌株，3株菌株仍能良好生長。因此，生物胺降解菌株在低pH或高pH的發(fā)酵環(huán)境中均能發(fā)揮降胺作用[19-21]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

從實驗室保存的不同來源的疑似乳酸菌中篩選出具有降解生物胺作用的菌株，經(jīng)16S rDNA序列分析，分別鑒定為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)；3株菌株對色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺均有不同程度的降解能力，其中植物乳桿菌HM24的降解能力最優(yōu)，對色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的降解率分別為(25.90±2.30)%，(35.75±2.71)%，(27.61±3.94)%，(25.91±3.76)%，(22.54±2.64)%，(34.55±1.90)%，39.25±1.86)%，(55.66±7.08)%；3株菌株在10%的高鹽濃度、pH 3.5的酸性環(huán)境到pH 9.5的堿性環(huán)境條件下仍有存活和生長能力。后續(xù)將對其實際應用進行研究[22-24]。