鮑曼不動桿菌所致呼吸機相關性肺炎患者血清IL-17 IL-35水平及與預后關系

羅鈺填， 呂常艷， 謝嶷松， 劉雪燕

(廣東省深圳市人民醫院重癥醫學科， 廣東 深圳 518000)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)是主要的醫院感染病原菌之一，近年來AB是導致重癥監護病房(Intensive Care Unit，ICU)呼吸機相關性肺炎(Ventilator-associated Pneumonia，VAP)死亡率升高的主要原因之一，且預后差[1]。及早發現影響AB所致VAP預后的因子對于疾病預后判斷有重要意義。白細胞介素(interleukin，IL)-17在VAP中水平升高可對VAP具有一定診斷價值[2]，而IL-17可調控相關免疫因子水平從而發揮作用。IL-35可調控T細胞相關亞群從而影響VAP的發展[3]。尚未發現關于IL-17、IL-35在AB所致VAP患者預后判斷的相關研究。基于此，本文通過檢測AB所致VAP不同預后患者血清中IL-17、IL-35的表達情況，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:深圳市人民醫院2016年7月至2018年10月127例AB所致VAP患者為研究對象，患者生存和死亡根據已確診為AB所致VAP為始，連續30d為限，30d時患者生存即為生存組，30d內患者死亡即為死亡組。84例患者生存(生存組)，男56例、女28例，年齡24～56歲，平均年齡(39.17±8.46)歲；43例患者死亡(死亡組)，男29例、女14例，年齡24～55歲，平均年齡(38.73±6.57)歲，兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。患者符合《呼吸機相關性肺炎診斷、預防和治療指南(2013)》診斷標準[4]。納入標準：①患者均符合上述診斷標準；②患者均進行氣管切開手術，且手術器皿等手術條件均相同，術后均用呼吸機輔助呼吸；③患者術前檢測均未發現氣管、肺等相關感染；④患者術后均出現昏迷狀況；⑤患者均根據醫囑咐，根據自身情況使用抗菌藥物。排除標準：①聯合感染所致VAP患者；②非首次VAP患者；③有抗菌藥物過敏史患者；④病例資料不完整患者。本研究經患者家屬知情并同意，經本醫院倫理協會審核并通過。收集兩組一般資料，包括性別、年齡、氣管切開手術時間、切口大小、術中出血量，急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)，其中APACHEⅡ評分[5]包括急性生理學評分、年齡評分、慢性健康狀況評分3部分，最后三項紙盒總計71分，分值越高病情越重。

1.2主要試劑與儀器:人IL-17酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國abcam公司，貨號：ab119535)，人IL-35 ELISA試劑盒(中國臺灣arigo，貨號：ARG81146)，CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP混合單克隆熒光抗體試劑盒(美國BD公司，貨號：20163402070)，酶標儀(賽默飛，型號：Multiskan GO)，流式細胞儀(貝克曼庫爾特，型號：CytoFLEX)。

1.3方 法

1.3.1樣品采集及保存:血清樣品采集：AB所致VAP患者均為確診翌日清晨空腹采集靜脈血5mL，部分室溫自然凝固，血樣3000r/min離心10min，收集上清后分裝做ELISA檢測；1.0mL添加抗凝劑檢測T淋巴細胞亞群水平。

1.3.2ELISA法檢測血清中IL-17、IL-35表達水平:按照人ELISA試劑盒說明書檢測IL-17、IL-35和標準品，待測樣品和標準品置于96孔板中，待測樣品6個重復，標準品3個重復，在450nm波長處測定各孔的OD值。在Excel工作表中，以標準品濃度為橫坐標、對應OD值為縱坐標繪制標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算血清中IL-17、IL-35水平。若待測樣品OD值超過標準曲線上限，則適當稀釋后重測，計算濃度=曲線方程計算濃度×稀釋倍數。

1.3.3流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群水平:流式細胞術檢測靜脈血中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞，流式專用管中每管取50μL，添加CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP混合單克隆熒光抗體，震蕩混勻后避光15min，添加紅細胞裂解液，混勻避光10min，洗滌后流式細胞儀上機檢測，計算CD3+T、CD4+T、CD8+T比例，并求CD4+/CD8+比值。

2 結 果

2.1兩組一般資料、APACHEⅡ評分比較:兩組性別、年齡、氣管切開手術時間、切口大小、術中出血量比較差異均無統計學意義(P>0.05)；與生存組相比，死亡組APACHEⅡ評分升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2兩組血清中IL-17、IL-35水平比較:與生存組相比，死亡組血清中IL-17、IL-35水平升高(P<0.05)，見表2。

2.3兩組T淋巴細胞亞群水平比較:與生存組相比，死亡組中CD3+T、CD4+T淋巴細胞水平、CD4+/CD8+比值降低(P<0.05)，CD8+T淋巴細胞水平升高(P<0.05)，見表3。

表2 兩組血清中IL-17 IL-35水平比較

表3 兩組T淋巴細胞亞群水平比較

2.4AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35與T淋巴細胞亞群、APACHEⅡ評分關系:Pearson法分析AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35與CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+均呈負相關(P<0.05)，與CD8+T、APACHEⅡ評分均呈正相關(P<0.05),見表4。

2.5影響AB所致VAP患者預后的因素分析:將AB所致VAP預后是否良好為因變量，以IL-17、IL-35、CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+、APACHEⅡ評分為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示IL-17、IL-35、APACHEⅡ評分是AB所致VAP預后的危險因素，CD4+/CD8+是AB所致VAP預后的保護因素，見表5。

表4 AB所致VAP患者血清中IL-17 IL-35與T淋巴細胞亞群 APACHEⅡ評分關系

表5 影響AB所致VAP預后的多因素分析

3 討 論

VAP是ICU患者常見并發癥，是導致ICU患者死亡的常見原因之一，是重癥監護醫師的主要挑戰[6]。預防VAP可減少ICU住院時間，提高患者生存率，AB感染在VAP患者中發生比例逐年上升，且病死率高[7]，及早發現AB所致VAP并盡早治療，對于改善ICU預后可能有重要意義。AB可改變患者免疫狀態，腦血管基礎疾病患者中AB為VAP的獨立危險因素[8]。APACHEⅡ評分顯示疾病嚴重程度，在AB所致VAP死亡患者中APACHEⅡ評分相較與生存組升高，提示疾病加重導致患者死亡。免疫功能紊亂及炎癥反應是導致AB感染后VAP發生、進展的重要因素。T細胞亞群參與免疫性疾病中細胞免疫應答，CD3+T代表成熟活化T淋巴細胞水平，可進一步分化為輔助T淋巴細胞CD4+T和毒性T淋巴細胞CD8+T，CD4+/CD8+比例降低反映機體免疫功能下降[9]。IL-17屬T細胞誘導的炎癥反應早期啟動因子，與免疫紊亂及炎癥密切相關[10]；IL-35被稱為免疫抑制因子，其水平升高可抑制T細胞增殖并抑制輔助T細胞Th17細胞的分化及功能，在免疫性疾病中發揮重要作用[11]。IL-35在慢性乙型肝炎病毒感染患者中表達升高，抑制免疫反應，抑制IL-35的表達可減緩疾病進程[12]。IL-17、IL-35在免疫缺陷性病毒感染和混合疾病中表達異常，調節T淋巴細胞發揮作用[13]。在帶狀皰疹和皰疹后神經痛患者外周血T淋巴細胞亞群計數與細胞因子表達水平的變化中發現，患者外周血中IL-17可能與機體免疫功能相關，隨著神經痛患者疼痛程度變化而變化[14]。

AB感染可引發VAP患者局部或全身免疫應答，導致T淋巴細胞亞群發生變化加重疾病進程[15]。本研究中，與生存組相比，死亡組中CD3+T、CD4+T淋巴細胞水平、CD4+/CD8+比值降低，CD8+淋巴細胞及IL-17、IL-35水平升高，提示AB感染所致VAP患者機體內活化T淋巴細胞數量減少，炎癥因子增加，產生的輔助T淋巴細胞比例降低，毒性T淋巴細胞比例增加，機體處于免疫失衡、炎癥反應狀態。本研究中，AB所致VAP患者血清IL-17、IL-35水平與APACHEⅡ評分均呈正相關，提示IL-17、IL-35與AB所致VAP疾病嚴重程度密切相關。另外，血清中IL-17、IL-35與CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+均呈負相關，與CD8+T呈正相關，提示AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35與T淋巴細胞亞群關系密切，可能影響T淋巴細胞亞群水平從而影響疾病嚴重程度。本研究發現，IL-17、IL-35、APACHEⅡ評分是影響AB所致VAP預后的危險因素，CD4+/CD8+是影響AB所致VAP預后的保護因素。IL-17、IL-35、APACHEⅡ評分升高、CD4+/CD8+降低均可增加AB所致VAP患者死亡幾率，在臨床上降低AB所致VAP患者血清中IL-17、IL-35水平可能改善AB所致VAP患者生存情況。

綜上所述，AB所致VAP患者死亡組IL-17、IL-35水平升高，二者與T淋巴細胞亞群關系密切，均是影響患者預后死亡的危險因素，可能作為指示性因子預測AB所致VAP患者預后狀況。但AB所致VAP患者預后的影響因素較多，可能亦受呼吸機使用時間等的影響，且本研究受病例數限制、納入一般資料有限，進一步收集更多患者參與分析是本研究接下來研究的重點，以進一步驗證本研究。