基于網絡藥理學探討高良姜治療胃潰瘍的活性成分及作用機制

秦貞苗 張力立 陳德梅 王寧 陳瑩子 吳鑫福 張俊清

中圖分類號 R656.6+2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）12-1440-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.07

摘 要 目的：探討高良姜治療胃潰瘍的活性成分及作用機制。方法：采用網絡藥理學方法，通過中藥系統藥理學分析平臺、中藥綜合數據庫檢索[口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18]和文獻挖掘，篩選出高良姜的活性成分和作用靶點;另在TTD、CTD、OMIM、PubMed、DrugBank、DisGeNet數據庫中獲取胃潰瘍的相關靶點，使用Venny 2.1軟件篩選高良姜活性成分與胃潰瘍的共同靶點;借助STRING數據庫獲得共同靶點的蛋白-蛋白相互作用（PPI）關系，使用Cytoscape 3.7.1軟件構建PPI網絡并分析;采用ClusterProfiler R功能包對共同靶點進行基因本體（GO）功能和KEGG通路富集分析;使用Cytoscape 3.7.1軟件構建“活性成分-靶點-通路”網絡并分析。結果：經篩選得到高良姜活性成分19個，活性成分作用靶點和胃潰瘍相關靶點分別有209、195個，兩者共同靶點35個。共同靶點PPI網絡的平均節點度值為18、平均介數為16.9，關鍵靶點共有11個，分別為PTGS2、VEGFA、IL6、IL1B、CCL2、MYC、MMP9、EGFR、HIF1A、ESR1，BCL2L1。共同靶點主要富集于血小板α顆粒腔、線粒體外膜等細胞組分，氧化應激反應、炎癥反應調節等生物過程以及蛋白磷酸酶結合、生長因子受體結合等分子功能，并富集于磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、低氧誘導因子1（HIF-1）等信號通路。“活性成分-靶點-通路”網絡顯示，高良姜中的槲皮素、芹菜素、山柰酚、高良姜素等活性成分是主要的藥效物質基礎，可能通過作用于PTGS2、NOS2、BCL2、IL6、VEGFA、IL1B、MMP9、BCL2L1等基因靶點，參與調控PI3K/Akt、HIF-1、腫瘤壞死因子、白細胞介素17、核轉錄因子κB等細胞增殖、血管生成、炎癥反應相關信號通路，從而起到抗胃潰瘍的功效。結論：高良姜具有多成分、多靶點、多通路抗胃潰瘍的作用特點。

關鍵詞 網絡藥理學;高良姜;胃潰瘍;活性成分;作用機制

Study on the Active Ingredients and Mechanism of Alpinia officinarum in the Treatment of Gastric Ulcer Based on Network Pharmacology

QIN Zhenmiao1，ZHANG Lili2，CHEN Demei1，WANG Ning1，CHEN Yingzi1，WU Xinfu1，ZHANG Junqing1（1. School of Pharmacy， Hainan Medical University， Haikou 571199， China; 2. Dept. of Cardiovasology，Hainan Provincial Peoples Hospital/Hainan Hospital Affiliated Hainan Medical University， Haikou 570311， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To explore the potential active ingredients and mechanism of Alpinia officinarum in the treatment of gastric ulcer. METHODS： By network pharmacology method， the active ingredients and action targets of A. officinarum were screened through TCMSP and TCMID database retrieval [oral bioavailability （OB）≥30% and drug like （DL）≥0.18] and literature mining. Targets of gastric ulcer were obtained in the TTD， CTD， OMIM， PubMed， DrugBank and DisGeNet databases. Venny 2.1 software was used to screen common targets for the active ingredients of A. officinarum and gastric ulcer. Then， the protein-protein interaction （PPI） of the common targets was obtained by STRING database， and the PPI network was constructed and analysed by using Cytoscape 3.7.1 software. GO function and KEGG pathway enrichment analysis of the common targets were performed by using ClusterProfiler R package. Finally， Cytoscape 3.7.1 software was used to construct and analyze the network diagram of “active ingredients-targets-pathways”. RESULTS： Totally 19 active ingredients of A. officinarum， 209 active ingredients targets and 195 gastric ulcer related targets， involving 35 common targets， were screened out. The average node degree of PPI network of common targets was 18， and the average intermediate number was 16.9. There were 11 key targets， i.e. PTGS2， VEGFA， IL6， IL1B， CCL2， MYC， MMP9， EGFR， HIF1A， ESR1， BCL2L1. The common targets were mainly concentrated in the cell constituents such as the platelet α granule lumen and mitochondria outer membrane， involved in the biological processes as oxidative stress， inflammatory response regulation， and molecular functions as protein phosphatase binding， growth factor receptor binding. They were also enriched in the signal pathways such as PI3K/Akt， HIF-1. The network of “active ingredients- targets-pathways”showed the active ingredients such as quer- cetin， apigenin， kaempferol and galangin in A. officinarum played an anti-gastric ulcer effect by acting on PTGS2， NOS2， BCL2， IL6， VEGFA， IL1B， MMP9， BCL2L1 and other targets to jointly regulate PI3K-Akt， HIF-1， TNF， IL-17， NF-κB and other cell proliferation， angiogenesis， and infla- mmation related ?pathways. CONCLUSIONS： A. officinarum shows anti-gastric ulcer effect with the characteristics of multi-ingredient， multi-target and multi-path.

KEYWORDS ? Network pharmacology; Alpinia officinarum; Gastric ulcer; Active ingredients; Mechanism

胃潰瘍（Gastric ulcer）是一種常見的消化系統疾病，其主要發病原因是胃黏膜防御、修復因子與進攻因子失衡[1]。導致失衡的因素有以下4個：一是幽門螺旋桿菌感染;二是長期服用對胃黏膜有損害的藥物;三是飲酒或吸煙;四是精神因素[2]。現代醫學提出了“無酸無潰瘍”的治療觀點，目前抗酸或抑酸類藥物是治療胃潰瘍的常規藥物，該類藥物雖然治愈率高，但停藥后患者復發率也高[3]。近年來，學者們廣泛開展的中醫藥治療胃潰瘍的臨床研究表明，中醫藥療法具有療效顯著、復發率低、毒副作用小等優勢[4]。

高良姜（Alpiniae Officinarum Rhizome）出自《名醫別錄》，為姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖。本品性熱、味辛，具有溫胃散寒、消食止痛的功效，常用于治療脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等癥[5]。現代研究表明，高良姜中主要含有黃酮類、二苯基庚烷類及揮發油類成分;除傳統療效外，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、治療胃潰瘍和保護胃黏膜等作用[6]。目前對高良姜治療胃潰瘍作用機制有一些報道，如魏娜等[7]通過實驗推測，高良姜水提物可能通過抑制炎癥因子分泌起到治療胃潰瘍的作用;江濤等[8]研究發現，高良姜總黃酮治療胃潰瘍的機制可能與抗氧化、清除自由基有關，但是這些單一靶點或者單一通路的研究難以全面解釋中藥多組分-多靶點-多通路的協同作用機制。基于現有文獻，本研究借助英國藥理學家Hopkins AL于2007年提出的“網絡藥理學”研究方法[9]，通過構建化合物與靶點、靶點與疾病的相互作用網絡，探討高良姜治療胃潰瘍的潛在活性成分、作用靶點和信號通路，以期為該藥治療胃潰瘍作用機制的進一步研究提供理論依據和新的思路。

1 資料

本研究所用數據庫、軟件和在線工具見表1。

2 方法

2.1 高良姜活性成分的篩選和作用靶點的預測

在TCMSP和TCMID數據庫中以“高良姜”為關鍵詞檢索高良姜的化學成分，使用口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，同時在中國知網和PubMed數據庫中以“高良姜”“胃潰瘍”為關鍵詞查閱文獻，將已有報道化學成分一并納入本研究。整理并刪除重復項后，將整理好的活性成分導入TCMSP數據庫中獲取潛在作用蛋白，并使用UniProt數據庫提取所有蛋白的基因名稱，選擇物種“Homo sapiens”，最終獲得高良姜活性成分的作用靶點。

2.2 胃潰瘍相關靶點的預測

在TTD、CTD、OMIM、PubMed、DrugBank、DisGeNet等數據庫中以“Gastric ulcer”為關鍵詞檢索與疾病相關的潛在作用靶點，經整理并刪除重復項后，最終獲得胃潰瘍的相關靶點。

2.3 共同靶點的篩選

將“2.1”“2.2”項下所得靶點導入Venny 2.1軟件中繪制韋恩圖，所獲得的交集靶點即為高良姜活性成分與胃潰瘍的共同靶點。

2.4 共同靶點相互作用網絡的構建

將“2.3”項下所得共同靶點導入STRING數據庫，選擇物種“Homo sapiens”，最低相互作用分值設為“Medium confidence（0.400）”，獲取相互作用關系。將相互作用關系的TSV格式數據導入Cytoscape 3.7.1軟件中繪制蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡，并使用該軟件的“CytoNCA”插件對該網絡進行節點度值、介數[10]的拓撲學屬性分析，明確PPI網絡中的關鍵靶點。

2.5 共同靶點基因本體（GO）功能和KEGG通路富集可視化分析

本研究使用ClusterProfiler R功能包對共同靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，對顯著富集（P<0.01）的功能和通路制作可視化柱狀圖和氣泡圖。P值越小，說明在該功能富集越顯著。GO功能可以分析靶點參與的生物學功能，包括生物過程、分子功能以及細胞組分;KEGG通路可以分析靶點參與的代謝通路。

2.6 “活性成分-靶點-通路”網絡的構建

整理富集在與胃潰瘍相關通路的靶點，找出作用于這些靶點的活性成分，以節點表示活性成分、靶點、通路，以邊表示某個活性成分作用于某個靶點或某個靶點與某條通路的關聯，建立三者的相互作用關系，將文件數據導入Cytoscape 3.7.1軟件中，繪制“活性成分-靶點-通路”網絡，并使用該軟件的“CytoNCA”插件對該網絡進行節點度數的拓撲學屬性分析，明確高良姜治療胃潰瘍多成分、多靶點、多通路的物質基礎和分子作用機制。

3 結果

3.1 高良姜活性成分和作用靶點

從TCMSP、TCMID數據庫中共得到高良姜活性成分16個。此外，經文獻挖掘和整理，發現黃酮類成分在治療胃潰瘍方面有一定數量的研究報道，因此將OB值未達標但研究證據較多的槲皮素-3-O-甲基、鼠李檸檬素和芹菜素也一并納入。最終，本研究篩選出活性成分19個，高良姜主要活性成分見表2。將上述活性成分輸入到TCMSP數據庫中查詢作用靶點，最終獲得其作用靶點209個。

3.2 胃潰瘍相關靶點

以“Gastric ulcer”為關鍵詞，在TTD（4個）、CTD（18個）、OMIM（25個）、PubMed（106個）、DrugBank（16個）、DisGeNet（94個）數據庫中共檢索到與胃潰瘍相關的靶點263個;經整理并刪除重復項后，最終獲得與胃潰瘍相關的靶點195個。

3.3 活性成分和胃潰瘍的共同靶點

將高良姜活性成分的作用靶點和胃潰瘍相關的靶點通過Venny2.1軟件篩選，得到共有靶點35個。這些靶點既是高良姜活性成分的作用靶點，也是胃潰瘍的相關靶點，提示高良姜可能通過上述35個共有靶點發揮治療胃潰瘍的作用。高良姜活性成分作用靶點和胃潰瘍相關靶點的韋恩圖見圖1，靶點信息見表3。

3.4 共同靶點PPI網絡分析

共同靶點PPI網絡中共有節點35個，邊320條;平均節點度值為18，平均介數為16.9。其中，節點表示靶點，邊表示靶點與靶點的相互作用關系;度值反映節點與其他節點的連接數目，度值越大，節點越大;介數是網絡中所有最短路徑中經過該節點的路徑數目與最短路徑總數之比[11]。本研究以網絡中度值和介數均不小于平均值的靶點作為高良姜治療胃潰病的關鍵靶點[11]。結果，該PPI網絡中共有關鍵靶點11個，分別是PTGS2、VEGFA、IL6、IL1B、CCL2、MMP9、MYC、EGFR、HIF1A、ESR1、BCL2L1。活性成分和胃潰瘍共同靶點拓撲學屬性信息見表3，PPI網絡圖見圖2（圖中，內圈為核心靶點）。

3.5 共同靶點GO功能富集分析

共同靶點在生物過程中富集了848個GO功能，主要富集于氧化應激反應、炎癥反應調節、活性氧代謝過程/反應、凋亡信號通路的調控等;在分子功能中富集了32個GO功能，主要富集于蛋白磷酸酶結合、生長因子受體結合、血紅素結合、抗氧化活性等以及在細胞組分中富集于血小板 α顆粒腔、線粒體外膜、囊腔、細胞器外膜等（P<0.01），以P值從小到大排序，詳見圖3。

3.6 共同靶點KEGG通路富集分析

設置P<0.01，共得到共同靶點參與的信號通路73條，以P值從小到大排序，前25條富集顯著的KEGG通路氣泡圖見圖4。

通過分析圖4中的通路，發現與胃潰瘍相關的信號通路有PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17、NF-κB[12-20]等通路，提示高良姜主要是通過調控這5條信號通路而起到治療胃潰瘍的作用。與胃潰瘍相關的KEGG通路富集信息見表4。

3.7 “活性成分-靶點-通路”網絡分析

基于“3.6”項下的5條信號通路構建“活性成分-靶點-通路”網絡，見圖5（圖中，外圈為活性成分，中間圈為靶點，最內圈為信號通路）。由圖5可見，該網絡中共有43個節點（包括15個活性成分、23個靶點、5條通路）和98條邊。節點越大表示其連接的化合物或者靶點或者通路越多[11]。該網絡中，作用靶點較多的活性成分是槲皮素、芹菜素、山柰酚和高良姜素，提示這些成分可能是高良姜治療胃潰瘍的物質基礎;連接活性成分和通路較多的靶點是PTGS2、NOS2、BCL2、IL6、VEGFA、IL1B、MMP9、BCL2L1，提示這些靶點可能是高良姜治療胃潰瘍的關鍵靶點，與“3.4”項下PPI網絡分析結果基本一致。由此可見，高良姜中的槲皮素、芹菜素、山柰酚、高良姜素等活性成分可能通過作用于PTGS2、NOS2、BCL2、IL6、VEGFA、IL1B、MMP9、BCL2L1等靶點，共同調控PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17、NF-κB等信號通路從而起到治療胃潰瘍的功效。

4 討論

高良姜資源豐富且藥用歷史悠久，臨床上主要用于治療胃腸道疾病[6]。本研究從TCMSP、TCMID數據庫中共篩選得到高良姜活性成分19個，其中黃酮類成分13個。通過構建活性成分與胃潰瘍共同靶點PPI網絡發現，PTGS2、VEGFA、IL6、IL1B、CCL2、MYC、MMP9、EGFR、HIF1A、ESR1，BCL2L1是關鍵靶點。將共同靶點進行GO功能富集，結果顯示，共同靶點主要富集于氧化應激反應、炎癥反應的調節等生物過程，與文獻結果[7-8]相吻合;此外，共同靶點還富集于蛋白磷酸酶結合等分子功能以及血小板α顆粒腔等細胞組分。

KEGG通路富集結果顯示，共同靶點富集顯著的前25條信號通路中，與胃潰瘍相關的有PI3K/Akt、HIF-1、TNF、IL-17和NF-κB通路。PI3K/Akt信號通路可參與細胞生長、增殖、分化過程的調節[12]，PI3K激活后可使3，4-二磷酸磷酰肌醇（PIP2）轉變為 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 作為第二信使分子將信號傳遞至下游的信號分子Akt，激活后的Akt一方面可以磷酸化促凋亡蛋白Bcl-2相關死亡促進因子（BAD），使BAD與Bcl-2解聚，發揮抑制細胞凋亡的作用，另一方面激活后的Akt可以促進細胞周期蛋白的降解，加速G1/S期的進程，發揮促進細胞增殖的作用，從而激活PI3K/Akt通路，通過抑制細胞凋亡、促進細胞增殖以達到修復胃黏膜損傷的作用[13]。HIF-1α是細胞在缺氧條件下的關鍵調控蛋白，徐丹妮等[14]證實肝郁脾虛胃潰瘍模型大鼠胃黏膜中HIF-1α呈高表達，說明胃潰瘍的發生同時伴有低氧環境。當機體處于缺氧狀態能量供應不足時，HIF-1α可對血管內皮生長因子（VEGF）及多種糖酵解酶的轉錄發揮直接調控作用[15]。VEGF是目前已知作用最強的血管生成促進因子，可通過酪氨酸激酶受體特異性地作用于內皮細胞，對內皮細胞增殖產生促進作用，并促進血管形成[16]。因此，缺氧狀態誘發的VEGF高表達有利于潰瘍部位上皮組織的修復和新生血管的生成，加速胃潰瘍的愈合。TNF、IL-17和NF-κB通路均與炎癥反應相關，炎癥反應是引起胃潰瘍難以愈合和復發的主要原因[17]。TNF-α是炎癥反應的起始因子，可以促進其他炎癥細胞因子如IL-6、IL-Iβ、IL-17等的釋放，并引起中性粒細胞的活化，進一步加重炎性損傷，從而形成胃潰瘍[18]。NF-κB是炎癥相關基因的重要轉錄因子，機體正常情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB以非活性復合物的形式分布在細胞漿中，當被有效刺激因子（如炎癥因子或生長因子等）激活后，IκB被IκB蛋白激酶（IKKs）磷酸化，然后經泛素-蛋白酶途徑使NF-κB從上述非活性復合物中解離出來并轉運到細胞核內，進而促進相關基因（如PTGS2、TNF-α、IL-6、IL-Iβ、IL-17等）的轉錄[19]。鄧連力等[20]發現，含有高良姜的良姜胃瘍膠囊可通過升高胃液pH，抑制胃蛋白活力，減少炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，抑制NF-κB通路相關蛋白的表達，從而發揮其對大鼠胃潰瘍的預防作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析了高良姜治療胃潰瘍的潛在活性成分和作用機制，發現同一化合物可調控多個靶點，同一靶點可參與多條信號通路，揭示了高良姜多成分、多靶點、多通路抗胃潰瘍的作用特點，為高良姜抗胃潰瘍實驗設計的優化和作用機制的進一步闡釋等提供了重要基礎。但由于目前研究中藥的網絡藥理數據庫仍存在數據資源可比性、準確性、完整性和可靠性等不足的問題[21]，使得所獲取的中藥化學成分及靶點可能存在差異，因此后期需通過文獻挖掘和相關實驗進一步證實高良姜治療胃潰瘍的作用機制。

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（收稿日期：2020-03-13 修回日期：2020-04-07）

（編輯：鄒麗娟）