新型納米HAP復合改性材料制備及其防齲性能研究

胡蓓蓓 李雪微 白海 賈婉萍 梁永強

鄰面去釉(interproximal reduction,IPR)是正畸醫師常用的一項臨床操作，通過磨除少量牙冠鄰面釉質來獲得矯治間隙，從而達到矯治的目的[1]。隨著3D重建技術，計算機輔助工程技術的發展，新型無托槽隱形矯治器成為了正畸醫生和患者們的新寵。隱形矯治技術中，輕度至中度牙列擁擠，牙齒形態、大小異常及Bolton比不調均考慮設計鄰面去釉操作[2]。而有學者[3-4]研究認為牙釉質厚度具有一定規律，鄰面去釉廣泛使用的同時也存在著一定的風險，牙齒在鄰面去釉后患齲的風險增加。本文旨在制備出一種新型防齲再礦化材料CPP-nHAP溶液，篩選出其對正畸鄰面去釉后釉質表面防齲作用的最佳濃度，希望能為臨床提供一種新型的防齲再礦化材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白磷酸多肽粉末(和光純藥工業株式會社，日本)；納米羥基磷灰石粉末(20 nm,北京髙德威金屬科技開發有限責任公司)；抽濾器(DHP-360，昆明玻璃儀器有限公司)；電磁力攪拌器(JB50-SH，上海標本模型廠)；超聲振蕩儀(DL-1000D，上海之信儀器有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，Vector-33，Bruker公司，德國)；多樂氟(高露潔棕欖有限公司，德國)；HVST-1000ZA顯微硬度儀(上海敏新檢測儀器有限公司)；電子游標卡尺(YB5001B，卡夫威爾有限公司)；硬組織切片機(E310CP，德國EXAKT)；恒溫水浴箱(常州智博儀器)；HDGC-9533BT型pH測定儀(北京華電儀器有限公司)；掃描電鏡(S-4800型，日本日立公司)；人工唾液配方：0.4 g氯化鈉、0.4 g氯化鉀、0.795 g無水氯化鈣、0.78 g硫化鈉、0.005 g磷酸二氫鈉和1 g尿素，用去離子水稀釋至1 L，pH調至7.0；人工脫礦液配方：0.52 g硝酸鈣，0.30 g磷酸二氫鉀，3.00 g冰醋酸，用去離子水稀釋至1 L，pH 4.5。

1.2 不同濃度CPP-nHAP溶液的制備

稱取1、3、5 mg的CPP粉末溶于純水中，磁力攪拌器充分溶解，得到100 ml濃度為1%、3%、5%的CPP溶液，再將11.11 g nHAP粉末溶于各濃度的CPP溶液中，使nHA的質量分數為10%，37 ℃水浴鍋內充分攪拌混勻，加入氫氧化鈉使溶液pH為8.0，再超聲震蕩3 次，使納米顆粒充分散開，得到濃度為1%、3%、5%的CPP-nHAP懸濁液(圖1)。可觀察到1%、3%、5%CPP-nHAP溶液流動性依次減小，均為乳白色懸濁液，其中5%的流動性最小，搖動離心管會出現溶質貼壁現象。

1.3 CPP-nHAP溶液防齲實驗

1.3.1 離體牙收集 收集新鮮完整、釉質發育良好的前磨牙50 顆，檢查是否有齲壞，是否存在色素沉著，脫礦的白堊色；是否經過牙冠及牙髓治療。檢查完畢后將50 顆牙齒納入研究。酒精反復擦拭，放入生理鹽水中，4 ℃保存,實驗所用牙齒均經過患者本人同意。

圖1 各組溶液性狀Fig 1 The solution properties of the groups

1.3.2 離體牙制備與分組 石膏固定50 顆標本牙，暴露牙冠，鄰面進行均勻去釉、拋光，游標卡尺測量最終去釉厚度為0.3 mm，相同方法處理牙冠兩側。去釉后金剛砂輪沿牙軸方向切開，分成100 個標本，用抗酸指甲油封閉形成去釉小窗口，隨機分為5 組,每組20 個標本。A組：不做任何處理，去離子水沖洗，2 次/d；B組：在去釉小窗口上均勻涂布多樂氟，干燥形成黃色薄膜，僅使用1 次，去離子水沖洗備用；C組：將標本置于1%CPP-nHAP懸濁液中浸泡5 min，2 次/d；D組：將標本置于3%CPP-nHAP懸濁液中浸泡5 min,2 次/d；E組：將標本置于 5%CPP-nHAP懸濁液中浸泡5 min，2 次/d。再根據測量方法將各組分為2 個小組，分別用于顯微硬度測量、掃描電鏡和能譜分析，每小組10 個標本。

1.3.3 體外pH循環 各組處理后的鄰面去釉標本進行體外pH循環，在37 ℃恒溫水浴箱中，上午8 時按分組進行再礦化處理5 min，11 時將標本浸泡于人工脫礦液中2 h，下午6 時繼續進行再礦化處理5 min，其余時間標本均置于人工唾液中，此為完成一次循環。標本每次換液前用大量去離子水沖洗，每日更換人工唾液和人工脫礦液，循環30 d。

1.4 主要檢測指標

1.4.1 溶液性狀觀察 取濃度為1%、3%、5%的CPP-nHAP、10%nHAP、CPP溶液置于無菌試管中，共5 個無菌試管，靜置24 h后觀察其性狀變化。

1.4.2 傅立葉變換紅外光譜掃描 3 組不同濃度的CPP-nHAP溶液抽濾冷凍干燥得到3 組固體粉末，將3 組固體粉末和nHA粉末各取1 mg，加入100 mg KBr研磨壓片，在傅里葉紅外光譜儀上進行4 000～400 cm-1波數掃描。

1.4.3 顯微硬度測量 用顯微硬度儀測量實驗前后牙釉質的顯微維氏硬度，載荷50 g，持續15 s，標本開窗區隨機測三點，求平均值。

1.4.4 掃描電鏡觀察及釉質表面元素分析 將實驗后的標本固定于載物臺上集中進行真空噴金處理，放入掃描電鏡真空室內觀察去釉表面形態，放大2 000 倍進行圖像采集。并用能譜儀分析釉質表面元素，計算鈣磷質量比。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0進行數據分析，組間均數比較釆用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 溶液性狀觀察

靜置24 h后，10%nHAP懸浮液出現分層現象，大量HAP小顆粒沉淀于離心管底部。1%、3%、5%CPP-nHAP組仍為乳白色懸濁液，管底有少量顆粒沉淀，其中1%組沉淀物比3%、5%組多(圖1)。

2.2 傅立葉變換紅外光譜分析

圖2 nHAP、CPP、CPP-nHAP紅外光譜圖Fig 2 FT-IR patterns of nHAP,CPP and CPP-nHAP

2.3 顯微硬度測量

防齲實驗后各鄰面去釉樣本的顯微硬度值及其差值見表1。由單因素方差分析可得出實驗前后標本的顯微硬度值差值有顯著性差異(P<0.05)，防齲制劑均在防齲實驗中產生了效果。防齲實驗前各標本之間顯微硬度值無顯著差異(P>0.05)，實驗結束后各標本之間的顯微硬度值有顯著性差異(P<0.05)，說明不同防齲再礦化劑對去釉后牙釉質的防齲效果影響各不相同。LSD-t檢驗進行組間兩兩比較后，實驗后濃度為1%的CPP-nHAP組與多樂氟組顯微硬度值無顯著性差異(P>0.05)，3%CPP-nHAP組硬度最大，而空白組的硬度最小。

表1 樣本處理前后各組顯微硬度測量值Tab 1 The MH values of the samples before and after treatment of the groups (n=10,

2.4 掃描電鏡觀察

對各組標本實驗后的釉質表面進行電鏡觀察(圖3)，空白組釉質表面粗糙不平，可見脫礦留下大小不一的低密度凹坑。多樂氟組可見有片狀物質不均勻沉積在孔隙表面，1%組釉質表面粗糙，有大小不一的脫礦孔隙，可見顆粒狀的礦物質沉積，有的孔隙內可見片層狀晶體沉積。3%組釉質表面的脫礦孔隙減少，可見表面形成不規則的礦化物沉積層。5%組釉質表面脫礦孔隙減少，可見礦物質部分沉積形成的沉積層，但較3%組礦化層不均勻。

圖3 5 組釉質表面形態(SEM,×2 000)Fig 3 The surface morphology of permanent enamel of the samples of the 5 groups(SEM,×2 000)

2.5 釉質表面鈣、磷比值

X線能譜分析顯示(表2)，實驗后5 組間釉質面鈣磷比值有顯著性差異(P<0.05)，具有統計學意義。兩兩比較可得出，1%、3%、5%組CPP-nHA組和多樂氟組鈣磷比值均大于空白組(P<0.05),3%組和5%組鈣磷比值無差異(P>0.05)，均大于其他各組(P<0.05)。

表2 樣本處理后各組釉質面所含的鈣磷比值Tab 2 The calcium and phosphorus ratio of the samples of 5 groups after treatment (n=10,

3 討 論

鄰面去釉是通過去除少量鄰面釉質使牙齒形態大小發生改變，來糾正患者牙齒比例不協調，輕中度牙列擁擠。隨著隱形矯治技術的流行，鄰面去釉技術的使用頻率大大增加。但鄰面釉質機械磨除后，會增加領面釉質的粗糙程度，使菌斑堆積殘留，釉質變薄，牙齒抗酸能力下降，去釉后的牙面的易患齲風險提高。鄰面去釉后防齲是不可忽視的問題，氟化物是目前使用最廣泛的一種，多數學者[5-6]認為氟化物能增強釉質抗酸能力，促進釉質再礦化，還有研究認為[7]氟化物中的氟離子與菌斑競爭鈣離子結合，減少菌斑的形成。姚博文等[8]研究發現氟化物處理后的牙面再次酸蝕仍能發現大量的片層狀礦化物沉積，氟化物能穩定的與牙釉質結合不易脫落。劉奕等[9]根據顯微硬度值，氟含量析出值評估多樂氟的再礦化能力優于5%氟化鈉溶液。雖然氟化物在防齲上取得了優良的效果，但有學者認為[10]，過量氟使用會導致氟中毒，兒童時期氟斑牙，耐氟菌株出現等不良副作用。

CPP-ACP是在中性和堿性環境下，從牛奶中提取的具有生物活性的載體物質(CPP)，與牛奶中提取的不定型磷酸鈣(ACP)結合形成的復合物質[11]。CPP作為礦物質的載體，結合易被牙齒吸收的磷酸根離子和鈣離子，減少釉質脫礦。Vyavhare等[12]體外防齲實驗認為，氟化物的防齲效果優于CPP-ACP糊劑，酪蛋白磷酸肽可以作為輔助手段聯合氟化物使用。納米羥基磷灰石(nHAP)與傳統的羥基磷灰石晶體結構不同，具有更強的生物活性.吸附性和溶解性[13-14]。劉成霞等[15]研究發現，粒徑20 nm的nHAP再礦化效果最佳，20 nm的nHAP可以牢固的吸附在釉質表面，提高釉質表面抗酸能力，減少釉質脫礦,但有學者認為[16]小粒徑的nHAP因其表面能高、納米結構的量子尺寸效應發生團聚，會影響再礦化作用。呂奎龍等[17]通過體外實驗證實nHAP對牙齒表面具有再礦化能力，經nHAP處理后，牙齒硬度明顯增大。Huang等[18]實驗比較證明nHAP促進早期釉質齲再礦化的最佳濃度為10%。

CPP作為礦物質載體，將nHAP加入不同濃度的CPP溶液中對nHAP改性，形成CPP-nHAP復合物，減少nHAP團聚作用。CPP-nHAP的FI-IR顯示均出現了nHAP和CPPs的綜合特征峰，O-H鍵，磷酸根，酰胺帶伸縮振動產生的吸收峰，考慮是 nHAP與CPPs不只發生了簡單的機械結合，還形成了化學鍵發生了化學作用，形成了性能穩定的復合材料。但關于濃度為3%CPP-nHAP特征峰偏移和強度的變化，考慮與二者內部結合方式有關，需進一步探討。nHAP組發生小顆粒聚集沉淀，溶液分層，而CPP-nHAP靜置24 h后，未發生顆粒沉淀，仍為性狀穩定的乳白色懸濁液，考慮一方面是CPP為粘性強的膠體溶液，nHAP均勻散布沉積在膠體溶液中，增強了nHAP的穩定性；另一方面是CPP與nHAP發生了化學反應形成了一種新的化學物質，CPP-nHAP復合物是一種乳白色懸濁液。在本實驗研究之初，課題組成員設定了1%、2%、3%、4%、5% 5 個濃度梯度，預實驗后結果顯示防齲效果1%組和2%組無統計學差異，3%和4%組無統計學差異，最終因此本著最低濃度的原則選取了1%、3%、5%進行了實驗比較。

Magalhaes等[19]認為多樂氟產品是美國FDA治療和預防齲病的金標準，本實驗選取多樂氟為陽性對照，通過體外防齲模擬實驗，采用掃描電鏡觀察釉質表面再礦化情況，X線能譜儀、顯微硬度儀測量鄰面去釉表面實驗前后鈣磷比，顯微硬度，用于評價再礦化劑的防齲效果。濃度為1%、3%、5%的CPP-nHAP在鄰面去釉后均能起到抑制釉質脫礦，防齲再礦化作用，濃度為1%的CPP-nHAP與多樂氟效果相當，而濃度為3%、5%的CPP-nHAP防齲效果均優于多樂氟，其中濃度為3%的CPP-nHAP溶液防齲效果最佳，為臨床防齲方面的應用提供一定的參考價值和理論依據。