口腔疣狀癌中PTEN的表達(dá)及其抑癌作用的初步研究

付鎮(zhèn)地 鄧雪花 顧立群 唐瞻貴

口腔疣狀癌(oral verrucous carcinoma,OVC)是一種好發(fā)于中老年人、具有典型推進(jìn)緣結(jié)構(gòu)、有局部侵襲性、分化程度高的惡性腫瘤[1]。OVC作為口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的一種獨(dú)特變種，有時(shí)很難將其與OSCC區(qū)分開來。1948 年，Ackerman[2]首次將口腔疣狀癌作為獨(dú)立的實(shí)體瘤從口腔鱗癌中劃分出來。目前，口腔疣狀癌的治療手段以手術(shù)切除為主，雖然大部分預(yù)后良好，但易復(fù)發(fā)；少數(shù)預(yù)后較差，易發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。造成這一獨(dú)特生物學(xué)行為的機(jī)制，目前尚不清楚。口腔疣狀癌的致病因素主要與咀嚼煙草、檳榔和感染人乳頭狀病毒(human papilloma virus，HPV)有關(guān)，本課題組及國內(nèi)外學(xué)者對口腔疣狀癌的發(fā)病機(jī)制做了大量工作，但其具體機(jī)制目前尚未完全清楚[3-9]。

磷酸酶及張力蛋白同系物(phosphate and tensin homolog，PTEN)是一種常見的抑癌基因，在多種腫瘤中突變或缺失[10]。PTEN通過調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括PI3K/AKT通路、FAK/p130cas通路、Shc/MAPK通路以及參與調(diào)控胰島素信號(hào)等，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管形成、維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定性等發(fā)揮其抑癌作用[10-11]。本研究運(yùn)用免疫組化法檢測PTEN在OVC中的表達(dá)，并對其抑癌作用進(jìn)行初步研究。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2000～2016 年中南大學(xué)湘雅醫(yī)院病理科確診并保存完好的OVC、OSCC石蠟標(biāo)本各20 例。OVC組男性13 例，女性7 例，平均年齡(52±14.2) 歲，原發(fā)于口腔且不伴發(fā)其他口腔腫瘤。OSCC組均為高分化鱗癌，其中男性16 例，女性4 例，平均年齡(55±8.2) 歲，也原發(fā)于口腔且不伴發(fā)其他口腔腫瘤。另經(jīng)患者及家屬同意取10 例外傷患者正常口腔黏膜(NM)標(biāo)本，固定、包埋，作為對照。其中男性6 例，女性4 例，平均年齡(32±12.3) 歲。

1.2 試劑耗材

Non-phospho PTEN(批號(hào)7960，兔，CST公司，美國)；AKT1(phospho S473)(EP2109Y兔，abcam公司，英國)；通用性免疫組化試劑盒(SP-9000,中杉金橋)；3%過氧化氫、PBS緩沖液、DAB顯色劑、蘇木紫、二甲苯等其他未列試劑(武漢博士德公司)。

1.3 免疫組化染色

切片厚度4 μm，40 ℃烘烤過夜；60 ℃烤片40 min置于梯度酒精：無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-95%酒精Ⅰ-95%酒精Ⅱ-70%酒精各10 min，PBS浸泡10 min；加入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，水浴30 min；150～200 μl 3% H2O2避光室37 ℃孵育10 min；山羊血清封閉37 ℃ 孵育20 min；一抗(pAKT 稀釋至1∶200,PTEN 稀釋至1∶200) 37 ℃溫箱孵育1 h；滴加B液37 ℃恒溫孵育 15 min；滴加C液37 ℃恒溫孵育 15 min。DAB顯色;蘇木素復(fù)染；空白對照以PBS緩沖液代替一抗。

1.4 染色結(jié)果判定

用Aperion ScanScope CS掃描切片，運(yùn)用配套的軟件量化核、膜或總表達(dá)水平。量化上皮細(xì)胞和癌變區(qū)域。核和膜的表達(dá)分?jǐn)?shù)(3+、2+、1+分別表示強(qiáng)、中、弱陽性染色)按公式(3+)*3+(2+)*2+(1+)*1計(jì)算。總量化的表達(dá)分?jǐn)?shù)被列為總強(qiáng)度或總細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各指標(biāo)在OVC組、OSCC組和正常組之間的表達(dá)差異采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey's檢驗(yàn)。PTEN與pAKT的相關(guān)性采用two tailed Pearson’s相關(guān)性分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有圖表均用GraphPad Prism 5.01 繪制。

2 結(jié) 果

2.1 PTEN的表達(dá)

PTEN在各組織的胞核胞漿中均有不同程度表達(dá)。通過免疫組化結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)PTEN在Nm中表達(dá)顯著高于OVC和OSCC。PTEN在OVC組中的表達(dá)低于Nm組，高于OSCC組(圖1)。

圖1 PTEN在NM、OVC、OSCC中的表達(dá)(免疫組化，×100)Fig 1 PTEN expression in NM,OVC and OSCC tissue(IHC,×100)

2.2 pAKT的表達(dá)

pAKT主要表達(dá)在OVC組和OSCC組的胞質(zhì)中，在Nm組中pAKT的表達(dá)教OSCC組和OVC組明顯降低，OVC組的pAKT表達(dá)水平較OSCC低(圖2)。

2.3 PTEN與pAKT相關(guān)性

在Nm、OVC、OSCC中PTEN與pAKT的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖3)。

3 討 論

口腔疣狀癌作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的亞型，其惡性程度低于口腔鱗癌。其獨(dú)有的“推進(jìn)緣”結(jié)構(gòu)是其有別于口腔鱗癌的病理學(xué)特征[7,12]。本研究中PTEN在口腔疣狀癌及口腔鱗癌中均低表達(dá)，這與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道PTEN作為抑癌基因在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)[13]，如肝癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌等相一致[14-18]。PTEN在口腔疣狀癌中的表達(dá)高于口腔鱗癌，說明PTEN的表達(dá)與腫瘤的惡性程度有相關(guān)性。張玉領(lǐng)等[17]對中國食管癌患者PTEN表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)性Meta分析發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Jolly等[19]發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中BRAF基因和PTEN基因的缺失導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌迅速發(fā)展為甲狀腺低分化癌。這些提示PTEN基因可能是一種抑癌基因并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PTEN基因定位在人類染色體的10q23位點(diǎn)，PTEN基因的編碼蛋白脂質(zhì)磷酸酶的活性對調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用，其可使細(xì)胞周期快速阻滯在G1期，從而促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡；PTEN可阻斷AKT通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及影響細(xì)胞周期。

圖2 pAKT在NM、OVC、OSCC中的表達(dá)(免疫組化，×100)Fig 2 pAKT expression in NM,OVC and OSCC tissue(IHC,×100)

圖3 在Nm、OVC、OSCC中PTEN、pAKT的相關(guān)性Fig 3 The correlation between PTEN and pAKT in Nm,OVC and OSCC

pAKT是AKT的磷酸化活化形態(tài)。AKT通路發(fā)揮功能的核心事件是AKT的磷酸化激活。AKT通路激活后可通過抑制凋亡機(jī)制、影響細(xì)胞周期及血管生成等方面影響細(xì)胞生命活動(dòng)[10,20-21]。PTEN通過使AKT通路激活的關(guān)鍵酶去磷酸化而發(fā)揮其抑癌作用[13]。呂夢欣等[18]指出在膀胱癌中miR-130b-3p通過抑制PTEN的表達(dá)，激活A(yù)KT通路及整合素β1/FAK信號(hào)通路，誘導(dǎo)凋亡，抑制膀胱癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲能力。本研究中PTEN在OSCC組、OVC組、Nm組中的表達(dá)依次升高并伴隨著pAKT表達(dá)的依次下降，PTEN與pAKT呈顯著負(fù)相關(guān)。提示PTEN在OVC和OSCC中的低表達(dá)或表達(dá)缺失激活了AKT通路，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Chi[22]研究發(fā)現(xiàn)miR194通過調(diào)控AGK激活A(yù)KT通路，抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞增值。Gao等[23]通過對舌癌的研究也發(fā)現(xiàn)PTEN可負(fù)調(diào)控AKT通路誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PTEN在口腔疣狀癌中低表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤惡性程度相關(guān)，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，PTEN與pAKT呈負(fù)相關(guān)，提示OVC中PTEN的低表達(dá)導(dǎo)致AKT通路激活，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。