一種新型膠原屏障膜在大鼠顱骨極限骨缺損區屏障作用的實驗研究

鈕春子 王鑫 程浩德 李德華

近年來種植修復已經成為越來越多的缺牙患者的主要修復方式，而臨床上可見各種原因導致的種植區骨量不足[1]。引導骨再生技術是臨床上用于增加缺牙區骨量的重要技術，其關鍵在于利用屏障膜保護缺損區的血凝塊，阻隔結締組織，為成骨細胞的遷移和增殖提供一個相對穩定的空間[2]。膠原因其良好的生物相容性、可生物降解，并可促進止血和傷口愈合等優異性能，成為制備屏障膜的理想材料[3-7]。Bio-Gide膜是目前臨床上應用廣泛的非交聯膠原膜，大量研究證實了其在引導骨再生中促進缺損區成骨的可靠性和有效性，但其價格昂貴且降解速率偏快，有專家建議覆蓋雙層膜以增加其屏障時間。本課題組以小牛皮來源的I型膠原纖維為原料，采用自然成膜的方法制備出一種自主研發的新型膠原膜。通過前期實驗研究證實，新型膠原膜具有良好的細胞生物相容性，在體外降解速率緩慢[8]。本實驗擬利用大鼠顱骨極限骨缺損模型[9]，進一步研究這一新型膠原膜的引導骨再生作用，為后期的臨床研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料和儀器 I型膠原纖維(常州藥物研究所提供)；Bio-Gide膜(Geistlich，瑞士)；環狀取骨鉆(Stoma，德國)；Micro-CT系統(Inveon,Siemens，德國)；蘇木精-伊紅染液(南昌雨露實驗器材有限公司)。

1.1.2 實驗動物 選取無特定病原體級別的SD大鼠(第四軍醫大學實驗動物中心)，雄性，7～8 周齡，體重300～320 g。

1.2 方法

1.2.1 新型膠原膜的制備 采用溶劑揮發法制備膠原膜，具體方法簡述為：以國產小牛皮(常州藥物研究所)為原料，在提取過程中篩選分子量，去除小分子膠原蛋白，保留長鏈膠原纖維。通過高速打勻的物理方法將不可溶性的膠原原料于弱酸中形成膠原混懸液，離心除去混懸液中的小分子和氣泡。將膠原勻漿置于真空干燥箱中梯度真空干燥，嚴格控制溫度不超過37 ℃以防止膠原變性，形成一種結構致密的新型膠原膜。包裝后環氧乙烷滅菌，常溫干燥環境下儲存備用[8]。新型膠原膜表面較平坦，呈半透明的乳白色。SEM示其結構致密，可見膠原纖維典型的串珠樣結構(圖1)。

1.2.2 建立大鼠顱骨極限骨缺損模型及實驗分組 12 只SD大鼠由1%戊巴比妥鈉(0.4 ml/100 g)經腹腔注射麻醉，以矢狀縫為中線，在大鼠頂骨左右兩側各制備直徑5 mm的圓形缺損，缺損區避開所有骨縫。

實驗分為3 組，實驗組、對照組和空白對照組，每組4 個樣本量。實驗組：覆蓋新型膠原膜；對照組：覆蓋Bio-Gide膜；空白對照組：不覆蓋屏障膜。膜的大小為9 mm×7 mm(前后方向超過缺損邊緣2 mm)。實驗動物及顱骨缺損左右側別采用隨機分配的方式進行分組。

分別于術后4、8 周處死大鼠，每組各2 只，取顱骨及其周圍軟組織進行檢測。

1.2.3 Micro-CT檢查及分析 4%多聚甲醛固定樣本，設定大鼠CSD區為感興趣區域，采用高分辨率的Siemens Inveon CT進行掃描。掃描分辨率：19.64 μm。將圖像進行三維重建，設置直徑5 mm、厚度1 mm的重建區，對CSD區新生骨組織進行計量學分析，具體參數為：骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)。

1.2.4 組織學HE染色觀察 樣本經4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣液脫鈣變軟后制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色。為保證各組切片片位相同，切片制取部位為缺損區正中區域同一長軸方向。光學顯微鏡觀察缺損區新骨形成和膜的降解情況。

1.3 統計學分析

2 結 果

12只實驗大鼠術后傷口愈合良好。

2.1 SD大鼠顱骨CSD區三維重建結果

術后4周的缺損區三維重建圖見圖2。實驗組和對照組CSD區的邊緣和中心區域均可見新骨形成，新生骨組織較薄。而空白對照組的新生骨主要集中于邊緣區域。

術后8 周的三維重建圖見圖2。實驗組和對照組的缺損區有明顯的新骨形成，新骨的厚度較高、連續性較好、骨橋的結構較完整。空白對照組的新骨形成亦有所增加，但中央區域仍未見明顯新骨形成。

2.2 SD大鼠CSD區各骨參數分析

術后在取材修剪樣本時不慎將8周的一個樣本(實驗/空白)毀壞，故8 周的實驗組和空白對照組只有3 組數據，其余均為4 組數據。骨參數數據統計結果見圖3。

4 周時，實驗組的各骨參數與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。

8 周時，對照組的BV/TV、Tb.N顯著地高于空白對照組，Tb.Sp、Tb.Pf顯著地低于空白對照組(P<0.05)。實驗組與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 SD大鼠CSD區術后三維重建圖Fig 2 Three dimensional reconstruction of the CSD after operation

圖3 大鼠顱骨CSD區術后4、8 周的新生骨組織各骨參數統計圖Fig 3 Statistical analysis of bone parameters in CSD 4 and 8 weeks after operation

2.3 SD大鼠顱骨CSD區組織學觀察

術后4周，實驗組和對照組的邊緣和中央區域均可見新骨形成(圖4)。新型膠原膜結構較完整，周圍可見少量淋巴細胞(圖5A)。Bio-Gide膜結構不清晰，降解顯著，周圍淋巴細胞和多核巨細胞浸潤明顯(圖5B)。空白對照組新生骨集中在邊緣區域，中央部位由結締組織充填(圖4)。

術后8 周，實驗組和對照組的缺損區均形成較完整的新生骨組織(圖4)。新型膠原膜的結構仍較清晰，膜內可見成纖維細胞和血管生成，淋巴細胞浸潤較4 周時增多，可見多核巨細胞(圖5D)。Bio-Gide膜進一步降解，結構不可辨認，膜內出現大量血管生成和脂肪組織，可見少量淋巴細胞(圖5E)。空白對照組缺損區新生骨組織向中央部位生長，但缺損區仍未獲得完全的骨修復(圖4)。

3 討 論

骨再生過程包括血管生成和成骨細胞從缺損區邊緣向中心的遷移，以建立一個具有良好血管化的肉芽組織區域，為編織骨的生成和骨質的沉積提供支架作用[10]。缺損區成骨細胞的增殖速率低于成纖維細胞，因此需要利用屏障膜在一定時間內維持缺損區的空間，為成骨細胞提供穩定的再生環境。膠原原料的種類、提取和加工過程、是否使用人工交聯等均會影響膜的降解速率[11-13]。本實驗以小牛皮的I型膠原為原料，采用自然成膜的方法制備出結構致密的新型膠原膜，將膜植入大鼠缺損區后，膜結構完整性維持的時間、膜內纖維細胞和血管的長入均顯著地慢于Bio-Gide膜，提示新型膠原膜的降解速率慢于Bio-Gide膜，這與前期體外實驗結果相符[8]。4 周時Bio-Gide膜內可見較多的淋巴細胞和多核巨細胞等炎性細胞，8周時隨著膜的降解炎性細胞明顯減少；而新型膠原膜則由4 周時的少量淋巴細胞到8周時增多的淋巴細胞和多核巨細胞。外源性的膠原在體內由中性粒細胞、單核/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和成纖維細胞等分泌的基質金屬蛋白酶降解[3,14]。在膠原膜的降解過程中伴隨著炎性細胞(淋巴細胞、巨噬細胞、多核巨細胞等)的變化，隨著膠原膜的降解，炎性細胞由多變少至逐漸消失[5,15]。本實驗中兩種膠原膜在降解過程中炎細胞的不同變化趨勢亦進一步證實新型膠原膜的降解速率緩慢。

NB：新生骨組織；BT：缺損區邊界的舊骨；FC：纖維結締組織；BM：屏障膜圖4 大鼠CSD區HE染色圖(×40)NB:New bone tissue;BT:Bone tissue by the defect;FC:Fibro-conective tissue;BM:Barrier membraneFig 4 HE staining of CSD(×40)

M：多核巨細胞；L：淋巴細胞；MB：新生骨組織；BM：屏障膜圖5 屏障膜周圍炎性細胞HE染色圖(×200)M:Multinuclear giant cell;L:Lymphocyte;NB:New bone tissue;BM:Barrier membraneFig 5 HE staining of inflammatory cells around the barrier membrane(×200)

機體的絕大多數組織在適宜的條件下可以不需要外力完成自我再生，當缺損過大而不能產生生物力學穩定的中央支架時，骨形成局限于缺損的邊緣穩定區域，而中央區域由松散的疏松結締組織占據[2]。本實驗成功建立大鼠顱骨雙側CSD模型，將新型膠原膜覆蓋缺損區，術后的三維重建影像和組織學分析顯示缺損的邊緣和中心區域均有新骨形成、新生骨連續性好，且8 周時形成較完整的骨缺損修復；對比空白對照組，骨再生效果顯著。愈合的早期(4 周)，在屏障膜的作用下，缺損區內形成穩定的血凝塊，成骨細胞可以快速遷移和增殖，在整個缺損區內形成新骨基質。隨著時間的進行，骨基質進一步沉積，形成更加完整和連續的新骨；而無膜覆蓋的缺損區內，快速增殖的纖維組織占據大部分區域，新骨形成局限于邊緣區。因此，無論是新型膠原膜還是Bio-Gide膠原膜，均成功阻攔成纖維細胞的競爭性增殖，促進缺損區的新骨形成。

本實驗以小牛皮為原料，通過自然成膜的方法成功制備出一種新型膠原膜，膜在大鼠體內與周圍組織整合良好，降解過程中未引起急性炎癥反應。在觀察的8 周內膜在大鼠體內發揮良好的屏障作用，顯著地促進缺損區骨再生。新型膠原膜在大動物體內的遠期屏障作用有待后續實驗進一步研究。

4 結 論

覆蓋新型膠原膜可以促進大鼠顱骨CSD區新骨形成，新型膠原膜在大鼠體內的降解速率顯著地慢于Bio-Gide膜，可能發揮更持久更完整的屏障作用。