過表達LATS2基因誘導口腔鱗癌細胞自噬的初步研究

岳增文 王樹斌 劉進忠

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),是口腔頜面頭頸部常見的惡性腫瘤，近年來發病率有上升的趨勢，目前在口腔癌中的比例已超過90%[1]。OSCC嚴重威脅著人們的健康，而明確其發病機制，有針對性采取預防和干預措施，一直是研究人員努力的方向。

前期研究中發現大腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor homolog 2,LATS2)基因在口腔鱗癌組織中的表達明顯低于正常口腔黏膜組織，且LATS2啟動子區域的高度甲基化與其低表達明顯相關[2-3]。通過過表達LATS2基因后口腔鱗癌細胞的增殖顯著受到抑制，且促凋亡蛋白Bcl表達明顯上調，細胞凋亡增加。先前的研究發現LATS2在腫瘤發展和細胞周期調控中起重要作用，并且可通過下調抗凋亡蛋白Bcl家族表達，以及誘導前凋亡蛋白Bax、p53和caspase3等方式促進細胞凋亡[4-5]。在細胞生理過程中，自噬、凋亡、程序性壞死都是細胞死亡形式，它們相互影響、相互調節，自噬可能在此過程中扮演重要的角色。本研究通過在口腔鱗癌細胞中過表達LATS2來觀察其對OSCC細胞自噬功能的影響，以探討其在OSCC發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人口腔鱗癌細胞株SCC-25(ATCC,美國典型培養物收藏中心)；慢病毒轉染LATS2于SCC-25的穩定細胞系已成功構建，該病毒載體無GFP熒光標簽。細胞于37 ℃、5%CO2細胞培養箱內常規孵育。DMEM/F12完全培養基、胎牛血清(Gibco公司,美國)；PBS、青霉素和鏈霉素(Hyclone公司,美國)；抗LATS2多克隆抗體、抗Beclin-1抗體(Abcam公司,美國)；抗LC3B抗體(Cell signaing公司,美國)；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 多克隆抗體(上海威奧生物技術公司)；H-800型透射電鏡(日立,日本)；熒光檢測儀、Leica SP8共聚焦顯微鏡(Leica公司,德國)；Western印跡熒光檢測增強化學發光(ECL)系統(Azure公司,美國)。對照組分為Control組、Lenti-control組，實驗組為Lenti-LATS2組。

1.2 Western印跡

提取轉染72 h后各組細胞，BCA法測量蛋白濃度，取40 μg蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜。于含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，加入一抗后，4 ℃封閉過夜。TBST洗膜3 遍，分別加入二抗IgG稀釋成1∶5 000，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜后，ECL法顯色蛋白條帶，然后進行凝膠成像分析，共3 次平行實驗。

1.3 共聚焦顯微鏡檢測自噬流

本研究采用雙腺病毒mRFP-GFP-LC3轉染已穩定表達LTAS2的SCC-25細胞。該系統中LC3攜帶有紅色熒光的mRFP和綠色熒光GFP，并可聚集在自噬前體和自噬體膜上，使其在熒光顯微鏡的紅綠合成圖像中呈黃色亮點；由于LC3攜帶的GFP綠色熒光在自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，所形成的酸性條件使GFP熒光淬滅，而mRFP紅色熒光耐受降解，使自噬溶酶體呈紅色亮點。據此可用來判斷自噬情況。為此，將MOI值為100的陰性對照腺病毒及mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒加入培養液中，培養8 h后進行半量換液；72 h后置于激光共聚焦顯微鏡下進行拍照。

1.4 透射電鏡觀察細胞超微結構

各組細胞以2×105/ml的密度接種于細胞培養瓶中，培養72 h后用細胞刮收集細胞，用不完全DMEM/F12培養液洗滌，離心沉淀后加入2.5%戊二醛固定2 h。PBS洗3 次，再用4 ℃預冷的1%鋨酸固定1 h，脫水后包埋，70 nm厚超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，應用透射電鏡進行觀察并拍照。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 LATS2對自噬相關蛋白變化的影響

Western印跡結果顯示，與空載體對照組和陰性對照組相比較，過表達 LATS2 的SCC-25細胞的LC3、Beclin-1蛋白表達水平顯著高于空載體組和陰性對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 過表達LATS2的SCC-25細胞中自噬相關蛋白的表達(*P<0.05，**P<0.01)Fig 1 The expression of autophagy-related proteins in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 免疫熒光檢測

LATS2基因在SCC-25細胞穩定過表達后，SCC-25細胞經雙熒光mRFP-GFP-LC3自噬流系統檢測自噬過程，即可見自噬體(黃色斑點)和自噬溶酶體(紅斑點色)數量有顯著增多，而對照組只有極弱而少的熒光斑點(P<0.05)(圖2)。

2.3 細胞超微結構觀察

與空載體對照組(Control)和陰性對照組(Lenti-control)相比，過表達 LATS2后，電鏡下SCC-25細胞質內出現自噬體和(或)自噬溶酶體的數量明顯增多(P<0.05)(圖3)。

3 討 論

自噬是一種非凋亡形式的程序性死亡方式，廣泛存在于真核細胞的病理生理過程中。當細胞亞細胞膜結構發生動態變化后，其溶酶體發動對細胞內蛋白質和細胞器降解的過程，并形成自噬體降解其底物。近年來隨著對自噬研究的不斷深入，其在腫瘤發生、發展中的作用引起更多人的重視。自噬在腫瘤發展中具有促進和抑制的雙重作用[6]。在腫瘤發展過程中，缺氧和營養缺失條件下能夠誘發細胞自噬的發生，通過對細胞內物質的降解而是新陳代謝發生變化，促使腫瘤細胞在應激狀態下作出適應性反應。Beclin-1是哺乳動物中與酵母菌Atg6同源的基因，在調節自噬起始囊泡形成過程中起重要作用[7]。研究人員發現在小鼠敲除自噬相關基因Beclin-1后，其癌癥的發病率明顯高于正常小鼠，提示自噬在腫瘤的早起有一定的抑制作用[8]。而在胃癌、乳腺癌研究過程中發現，當細胞自噬受到抑制后，細胞凋亡明顯增多[9-11]。而在腫瘤的治療過程中，通過提高自噬活性可以及時清除化療或放療后腫瘤細胞產生的破損細胞器和損壞的蛋白質等有害成分，并為受損的細胞提供應急底物和能量，以促進細胞的修復[12]。由此可見，自噬對腫瘤既有殺傷作用，又有保護作用，合理利用自噬的這一特性，或許能為腫瘤的治療提供新的思路。

圖2 過表達LATS2的SCC-25細胞自噬流(*P<0.05，**P<0.01)Fig 2 Autophagy flux in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(*P<0.05，**P<0.01)

圖3 過表達LATS2后SCC-25細胞自噬顆粒(TEM)(* P<0.05)Fig 3 Autophagy granules in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(TEM)(* P<0.05)

LATS2基因位于13q11-q12，負責編碼絲/蘇氨基酸蛋白激酶，定位于中心體，通過積累微管蛋白和紡錘體的形成來調控細胞周期而發揮抑癌基因的作用[13]。前期的實驗發現，在OSCC中LATS2基因的表達與SCC-25細胞的凋亡數量成正相關。Yang等[14]發現在肝癌細胞中上調LATS2基因后，細胞的凋亡明顯增加，認為自噬可能在其中扮演了重要的角色。LC3蛋白是酵母自噬相關蛋白(Atg8)的同源蛋白，在合成后其C末端即被Atg4蛋白酶切割轉變為LC3-I并散在分布于細胞質內，當自噬被誘導后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺偶聯形成LC3-II并始終穩定地錨定于自噬體膜上直至與溶酶體融合，因此通常把LC3-I與LC3-II作為自噬標志物[15]。另外，作為自噬誘導物，Beclin-1也可作為自噬和凋亡的重要橋梁。Bcl-2蛋白家族成員不僅調節著凋亡，而且調節著自噬。研究發現Beclin-1可以通過 BH3區與Bcl-2蛋白家族結合，兩者結合后競爭性抑制磷脂酰肌醇3-激酶與Beclin-l的結合，使自噬小體形成過程受阻，使自噬作用受到抑制[16]。當Beclin-1從 Beclin-1與Bcl-2所形成的異源二聚體解離后，Beclin-1激活自噬信號通路使自噬過程啟動[17]。金龍等[18]在舌鱗癌細胞SCC-15細胞中發現，在過表達NOD2基因后，誘導細胞自噬可以抑制細胞的增殖和遷移。而實驗發現在口腔鱗癌細胞過表達LATS2基因后自噬相關基因LC3 蛋白、Beclin-1蛋白的表達均明顯增強；雙熒光自噬流以及透射電子顯微鏡觀察到SCC-25細胞質內的自噬體和自噬溶酶體明顯增多。先前研究中發現過表達LATS2基因后Bcl-2表達的下調，推測LATS2的上調使Bcl-2的表達受到抑制，這樣促使Beclin-1與Bcl-2所形成的異源二聚體解離，釋放出更多的Beclin-1，從而激活自噬。

自噬現象貫穿于真核細胞生長的全過程，在OSCC的不同階段可能發揮著不同的作用。調控OSCC細胞自噬活性，是否能誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞進展，仍需進一步研究。促進自噬被認為是治療腫瘤的一個潛在途徑，而進一步研究LATS2誘導SCC-25細胞發生自噬的機制，有助于為OSCC的研究提供新的思路。