黃龍止咳口服液對咳嗽變異性哮喘模型小鼠的作用機制研究*

王春燕，隆紅艷

（1.南京中醫藥大學研究生院，南京 210029；2.南京中醫藥大學附屬南京中醫院，南京 210023）

咳嗽變異性哮喘（CVA）又稱變異性哮喘、隱匿性哮喘，是引起中國兒童尤其是學齡前和學齡期兒童慢性咳嗽的最常見原因，臨床以咳嗽為唯一或主要表現[1]。CVA的發病機制尚不明確，目前認為是由多因素共同作用引起氣道慢性炎癥、氣道高反應性和氣道重構的結果，報道稱有超過30%的CVA患兒最終發展成典型哮喘[2]。目前的臨床診治方法與哮喘相似，多以吸入性糖皮質激素、支氣管擴張劑和白三烯受體拮抗劑為主，雖見效快，但長期服用不良反應大，停藥后易復發，加上低齡兒童對于吸入療法依從性差，導致治療效果不甚理想。本病中醫屬于“風咳”范疇[3]，黃龍止咳口服液（HLOL）作為南京中醫藥大學附屬南京中醫院治療兒童CVA的有效驗方，多年來在臨床取得顯著的療效。前期的臨床研究已經證實，在使用黃龍合劑1個療程（2周）后，患兒第1秒用力呼氣量（FEV1）、最大呼氣流量（PEF）有明顯改善，血中嗜酸性粒細胞計數和T淋巴細胞亞群CD4+、白細胞介素（IL）-4均顯著降低，進而使支氣管痙攣得到有效緩解，減輕氣道炎癥，降低氣道高反應性，顯著改善持續性咳嗽等臨床癥狀[4-5]。動物實驗研究也表明黃龍合劑可以有效降低氣道周圍炎性細胞浸潤程度，減少氣道壁和血管周圍膠原沉積，抑制細胞炎癥因子的釋放，最終改善肺功能障礙和氣道重塑[6]。本研究觀察HLOL對CVA模型小鼠氣道炎癥及Toll樣受體（TLR）4/髓樣分化因子（MyD88）/核轉錄因子-κB（NF-κB）通路的影響，從而探討HLOL治療CVA的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性BALB/c小鼠（18～22g），由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗前在標準實驗室條件下飼養1周[許可證號：SYXK（蘇）2016-0018]。動物的處理遵守國家健康協會制定的實驗動物護理和使用指南[7]。

1.1.2 藥物 HLOL由麻黃、地龍、苦杏仁、前胡、桑白皮、蟬蛻、紫蘇子、旋覆花共8味藥組成，其中前胡、桑白皮、紫蘇子使用醇提，其藥渣與剩余5味合并水煎。水煎液和醇提液混合并濃縮，得到生藥量1.5 g/mL，調整pH值，加防腐劑，靜置后取上清即得。地塞米松（Dex）（生產批號：CD170417b）。

1.1.3 主要試劑及儀器 卵蛋白（OVA）（批號：1002638270）、氫氧化鋁（批號：21645-51-2）、乙酰甲膽堿（Mch）購于美國Sigma-Aldrich公司，白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購于 Elabscience 公司，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體購于美國Cell Signaling公司。

O2AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備有限公司），超純水系統（美國Thermo公司LabTower），正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司BX43），全波長酶標儀（美國Bio-TekEpoch），全自動洗板機（美國Bio-Tek ELX50），蛋白成像系統（美國 Bio-Rad ChemiDoc XRS+），小鼠無創肺功能儀（Buxco American）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將50只雌性BALB/c小鼠隨機分為5組，分別為正常組、OVA組、Dex組、HLOL低劑量組、HLOL高劑量組，每組10只。

1.2.2 動物模型建立 參照文獻方法建立模型[8-9]，采用OVA和氫氧化鋁激發致敏，并用OVA霧化激發來建立CVA模型小鼠。所有小鼠飼養1周，于第1、7、14 天，正常組小鼠每只腹腔注射 200 μL 生理鹽水，其他各組小鼠每只腹腔注射200 μL致敏液（含OVA 100 μg，氫氧化鋁 20 μg，溶解于生理鹽水溶液中）致敏。末次注射1周后，除正常組外其余各組均以1.5%OVA溶液進行超聲霧化，每日30 min，連續激發14 d。每次激發前1 h，Dex組以Dex片配制成溶液后以2 mg/kg灌胃，HLOL低劑量組0.75 g/kg、高劑量組1.5 g/kg等劑量灌胃，正常組和模型組以等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 標本收集 在最后1次給藥激發后24 h測定部分小鼠的氣道反應性，處死小鼠，摘眼球取血，12 000 r/min離心，離心半徑為21 cm，離心后取上層血清，置于-80℃凍存。打開小鼠胸腔，取左側肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，經石蠟包埋、切片、染色，其余肺組織于-80℃凍存。

1.2.4 小鼠氣道反應性測定 末次激發24 h后，Buxco無創肺功能儀檢測小鼠增強的呼吸間歇（Penh），首先測定小鼠基礎Penh值1 min，隨后測定倍增濃度Mch霧化激發后Penh的變化，每次霧化2 min，記錄3 min。Mch激發濃度由低到高，記錄各濃度Mch激發下的Penh值。

1.2.5 ELISA法測定小鼠血清中總免疫球蛋白E（IgE）及IL-4、IL-5、IL-13的含量 根據ELISA試劑盒說明書的步驟，依次檢測血清中總IgE、IL-4、IL-5和IL-13的含量，并進行分析。

1.2.6 肺組織學檢查 將固定后的左肺依次進行脫水、浸蠟、包埋等步驟，并進行蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.2.7 免疫組化檢測 石蠟切片常規脫蠟、脫水，并置于100℃的抗體修復液中修復30 min，根據說明書按比例制備兔抗鼠TLR4和磷酸化（p）-NF-κB p65抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，孵育二抗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色、蘇木精復染，封片后觀察并拍照。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測 收集肺組織并裂解，二喹啉甲酸（BCA）法測定樣品蛋白濃度。每個泳道加等量的蛋白樣品分離后，轉移到PVDF膜上，封閉后分別加入一抗（TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65）4 ℃過夜。二抗孵育后加入ECL熒光試劑，進行圖像采集和數據分析。

1.3 統計學分析 實驗結果均以SPSS 23.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HLOL對各組小鼠肺組織病理學改變比較 相較于正常組，OVA組小鼠肺組織切片可見氣道平滑肌增厚，支氣管及血管周圍有大量炎性細胞浸潤。經Dex治療后仍有炎性細胞浸潤，HLOL各組肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，支氣管壁結構相對完整，減輕了OVA誘導的氣道炎癥。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片（HE染色，200×）

2.2 HLOL減輕小鼠氣道高反應性（AHR） 除正常組外，其余各組Penh值都有隨Mch升高而增加的趨勢。與正常組相比，OVA組的AHR顯著增加（P＜0.01），用藥治療后均能降低氣道Penh值（P＜0.01），因此，HLOL能有效降低CVA模型小鼠的AHR。見圖2。

圖2 各組小鼠 AHR（±s，n=10）

2.3 HLOL對小鼠血清細胞的影響 與正常組相比，OVA組小鼠血清中總細胞數與嗜酸性粒細胞（EOS）、淋巴細胞（LYM）和中性粒細胞（NEU）的細胞數較正常組明顯升高（P＜0.01）。與OVA組相比，HLOL各組的總細胞數與EOS、LYM、NEU均明顯減少（P＜0.01），Dex組減少更為明顯。見圖3。

圖3 各組小鼠血清總細胞和各炎癥細胞計數（±s，n=10）

2.4 HLOL可降低血清總IgE和炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13的水平 與正常組比較，OVA組血清中IgE 和 IL-4、IL-5、IL-13含量明顯增高（P＜0.01）；與OVA組比較，各治療組IgE和炎癥因子均明顯降低（P＜0.01），提示各治療組均對CVA有一定的治療作用。相較于HLOL低劑量組，高劑量組的作用更明顯。見圖4。

圖4 ELISA法測定各組小鼠總IgE和IL-4、IL-5、IL-13 水平（±s，n=10）

2.5 HLOL對肺組織中TLR4/NF-κB信號通路的影響 OVA組小鼠肺組織中TLR4、MyD88和p-NF-κB p65的蛋白表達明顯高于正常組（P＜0.01），經治療后各蛋白含量明顯降低（P＜0.01），表明HLOL可以抑制TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白的表達。見圖5。

免疫組化可見經OVA刺激后氣道周圍TLR4和p-NF-κB P65蛋白明顯聚集，而HLOL各組較OVA組蛋白水平均有不同程度的減弱。見圖6。由此可見，HLOL減弱OVA誘導的過敏氣道炎癥可能與TLR4/NF-κB信號通路有關。

3 討論

CVA是一種過敏性氣道炎癥性疾病，以氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為主要病理基礎，涉及多種炎癥介質和細胞因子。兒童CVA的發病機制尚不明確，大多數研究認為是由環境、遺傳、感染及免疫等因素相互作用所致。

圖 5 各組小鼠肺組織 TLR4、MyD88、NF-κB p65 表達的影響（±s，n=10）

圖6 各組小鼠肺組織TLR4和p-NF-κB p65免疫組化染色（400×）

現代研究普遍認為Th1/Th2細胞亞群的失衡是CVA的重要發病機制之一[10]，Th2細胞刺激的2型免疫應答與過敏和哮喘有關，其特征在于高抗體滴度和EOS增多。CVA發病過程中Th0過多向Th2轉化，從而使Th1細胞激活受抑制[11]。Th2細胞主要分泌炎癥細胞因子IL-4、IL-5和IL-13，能介導氣道黏膜的炎癥，加重CVA并促使其向哮喘發展。其中IL-4、IL-5 能誘導 IgE 的產生，趨化 EOS[12]；IL-13 刺激EOS，引起AHR、黏液產生和膠原沉積[13]，三者共同作用，促使CVA氣道炎癥形成和發展。因此抑制這3種炎癥因子的生成是治療CVA的有效途徑。

TLR4作為參與非特異性免疫的重要蛋白，能夠識別外源性病原體并調控免疫，從而調節機體Th1和Th2兩種細胞的平衡。NF-κB在多種細胞中廣泛表達，正常情況下，NF-κB與其抑制劑IκB結合而失活。然而，在異常狀態下，當上皮細胞受到刺激和損傷（如過敏性疾病）時，由于某些因子的激活，IκB與NF-κB分離，導致NF-κB活化，進而引起大量炎癥因子基因表達[14]。TLR4能通過激活NF-κB信號通路，引起多種炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-13基因的表達，這些表達的炎癥因子又重新激活了NF-κB通路，形成滾雪球式的正反饋調節[15]。

HLOL是由8味中草藥組成的混合物，其中麻黃作為止咳平喘的代表藥物，被證實能抑制細胞免疫和體液免疫，有抗哮喘作用，可緩解氣道平滑肌的收縮[16-17]；地龍具有松弛平滑肌、抗炎殺菌、平喘和免疫調節作用，研究發現地龍可有效抑制NF-κB的活化，降低IL-4、IL-5和IL-13的水平，減少體內EOS炎癥[18]；苦杏仁可平喘鎮咳，亦有抗炎作用；紫蘇子能一定程度上抑制過敏反應；桑白皮、前胡均能鎮咳祛痰；蟬蛻、旋覆花能緩解氣道高敏反應狀態，解除支氣管平滑肌痙攣。

本次研究發現，HLOL能抑制CVA小鼠血清NEU的增多，減少CVA小鼠肺組織炎性細胞的浸潤，降低AHR。HLOL通過抑制上游TLR4與MyD88結合，從而抑制TLR介導的MyD88依賴信號轉導途徑，進一步降低或延遲下游NF-κB信號通路的活化，減少促炎細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的釋放，從而緩解臨床癥狀。總而言之，HLOL能夠有效改善CVA模型小鼠的氣道炎癥及AHR，也為臨床診治小兒CVA提供新的治療思路，有望成為專病新藥應用于臨床中。